Effets inflammatoires et toxiques des préparations ophtalmiques topiques sur la surface oculaire : développement et standardisation de modèles d'évaluation in vitro et in vivo

by Aude Pauly

Doctoral thesis in Toxicologie

Under the supervision of Françoise Brignole-Baudouin.

defended on 2008

in Paris 5 , under the authority of École doctorale du Médicament (....-2009 ; Paris) , in a partnership with Université Paris Descartes. Faculté de pharmacie de Paris (autre partenaire) .

Alternative Title

Eyedrop’s inflammatory and toxic effects on the ocular surface: development and standardization of in vivo and in vitro evaluation models

Abstract

The REACH program and the future ban to use animals for the toxic evaluation of cosmetics in 2013 impose to revise the classic tools of eye toxicity testing and to develop new approaches. We first used classic in vitro systems to investigate the toxicity of antiallergic eye drops by evaluating the induction of oxidative stress, apoptosis and inflammation. We were so able to connect their toxicity to the presence of benzalkonium chloride (BAC), the common eyedrop preservative used as the irritant of reference in our studies. Then we used flow cytometric analysis of conjunctival brushings, in conjunction with multiple cytokine assays in tears and in vivo confocal microscopy (IVCM) of the cornea as sensitive and noninvasive tools to refine the classical Draize eye test. In the perspective of future multicenter studies, we standardized the use of IVCM by developing a scoring system, based on the corneal thickness measurement and the precise classification of cytological and histological changes, at the level of the epithelial cells, the keratocytes, the endothelial and the vascular cells. This system enables to deliver a gravity score, as an objective numerical value for the assessment of the toxic-induced corneal damage severity. In vitro, using a reconstituted human corneal epithelium model, we developed a new, more sensitive MTT procedure for the evaluation of cytotoxicity, and correlated this method with a panel of immunohistological tests covering inflammatory, as well as apoptotic and proliferative mechanisms

keywords

• Oeil -- Effets des médicaments
• Oeil -- Effets des produits chimiques
• Médicaments ophtalmiques -- Toxicologie

Abstract

Le programme REACH et l’interdiction d’utiliser les animaux pour tester les produits cosmétiques en 2013 imposent de revoir les outils classiques d’évaluation de la toxicité oculaire et de développer de nouvelles approches. D’abord, nous avons utilisé des systèmes in vitro classiques pour explorer la toxicité de collyres antiallergiques grâce à des tests de stress oxydant, d’apoptose et d’inflammation et nous avons ainsi pu relier leur toxicité à la présence de chlorure de benzalkonium (BAC), conservateur et irritant de référence des collyres dans nos études. Ensuite, nous avons enrichi le test classique de Draize, de méthodes sensibles et non invasives telles que l’analyse en cytométrie en flux des cellules de la conjonctive, le dosage de cytokines dans les larmes et l’analyse en microscopie confocale in vivo (IVCM) de la cornée. Dans le but d’une standardisation indispensable à la conduite d’études toxicologiques multicentriques, nous avons développé une classification précise des différentes altérations cytologiques et histologiques, allant de la cellule épithéliale, aux kératocytes, aux cellules endothéliales et vasculaires. Associée à la mesure de l’épaisseur cornéenne, elle a permis de construire une échelle de cotation de gravité des lésions cornéennes, délivrant un score, valeur numérique objective, associé à un profil de sévérité toxique. In vitro, sur des épithéliums cornéens humains reconstruits, nous avons mis au point une nouvelle procédure de test MTT, plus sensible pour l’évaluation de la cytotoxicité et l’avons corrélé à une batterie de tests immunohistologiques couvrant des mécanismes d’inflammation, d’apoptose et de prolifération