Structural studies on proteins involved in nonsense-mediated mRNA decay

• Auteur / Autrice : Jan Kadlec
• Direction : Stephen Cusack
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance en 2005
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Résumé

Un mécanisme de contrôle permet aux cellules eucaryotes de détecter et dégrader les ARN messagers (ou ARNm) contenant des codons Stop prématurés, il est appelé NMD (pour Nonsense-mediated mRNA decay). Trois protéines, UPF1, UPF2 et UPF3, sont essentielles à ce processus chez tous les eucaryotes, de la levure à l'humain. Nous avons résolu la structure cristalline à 1. 95 A de résolution du complexe formé par les domaines d'interaction entre UPF2 et UPF3b humains, qui sont, respectivement, un domaine MIF4G (Middle portion of eIF4G) et un domaine RRM (RNA Recognition Motif ou motif d'interaction à l'ARN). Cette structure, montre que l'interaction protéine-protéine est médiée par des résidus chargés très conservés dans UPF2 et UPF3b et implique la surface du feuillet-β du domaine RRM de UPF3b, généralement utilisée par ces domaines pour lier les acides nucléiques. Nous prouvons que le domaine RRM de UPF3b ne lie pas l'ARN, tandis que le domaine MIF4G de UPF2 et le complexe UPF2-UPF3 le lient. Nous avons également obtenu des cristaux du complexe entre les domaines d'interaction entre UPF2 et UPF1. Enfin, nous avons déterminé la structure du site de fixation de UPF2 de UPF1 à 3. 0 A de résolution. Nos résultats proposent une organisation des mécanismes moléculaires à la base du processus de contrôle de qualité du NMD.

Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a surveillance mechanism by which eukaryotic cells detect and degrade transcripts containing premature termination codons. Three 'up-frameshift' proteins, UPF1, UPF2 and UPF3, are essential for this process in organisms ranging trom yeast to human. We solved a crystal structure at a resolution of 1. 95 A of the complex between the interacting domains of human UPF2 and UPF3b, which are, respectively, a MIF4G (middle portion of eIF4G) domain and an RRM (RNA recognition motif) domain. The protein-protein interface is mediated by highly conserved charged residues in UPF2 and UPF3b and involves the beta-sheet surface of the UPF3b RRM domain, which is generally used by these domains to bind nucleic acids. We show that the UPF3b RNP does not bind RNA, whereas the UPF2 construct and the complex do. We also obtained diffracting crystals of the complex consisting of the interacting domains UPF2 and UPF1. Finally, we determined the structure of the UPF2-interacting domain of UPF1 at a resolution of 3. 0 A. Our results advance understanding of the molecular mechanisms underlying the NMD quality control process.