Expression du récepteur de la prolactine dans le système immunitaire et le cancer du sein : vers de nouveaux rôles pour la prolactine en pathologie humaine ?

by Philippe Touraine

Doctoral thesis in Médecine. Endocrinologie, interactions cellulaires

Under the supervision of Paul Kelly.

defended on 1999

in Paris 11 .

Thesis committee President: Claude Kordon.

Thesis committee members: Claude Kordon, Vincent Geenen, Henri Magdelenat, Frédérique Kuttenn, Micheline Misrahi, Louis-Marie Houdebine.

Examiners: Vincent Geenen, Henri Magdelenat.

Abstract

The objective of my thesis was to further elucidate the involvement of prolactin (PRL) In the murine and human immune system, but also to study the oncogenesis of human breast cancer, by evaluating the expression of the prolactin receptor (PRLR) and the generation of fragments of human PRL. The project was thus implemented in two phases. In the first phase, PRLR expression was characterized in the murine and human immune system. Characterization was first performed in the mouse and rat, using flow cytometry and antibodies against PRLR. A ubiquitous expression of PRLR was seen in the various lymphocyte sub-populations analyzed. Since PRL is involved in the pathogenesis of the lupus syndrome in the NZB mouse, the expression of PRLR in that model was addressed. PRLR expression was shown to increase with age in the NZB mouse, suggesting that the PRLR may contribute to development of the disease. In addition, the expression of PRLR messenger in mouse and rat thymus, bone marrow, spleen and lymph nodes was identified using RT-PCR. We were thus able to demonstrate that mRNAs encoding a short and long form of PRLR were expressed in each of the above tissues. Moreover, demonstration of PRL synthesis in rat thymus enabled identification of lymphocytes as an extra-pituitary source of prolactin. Lastly, we investigated PRLR expression in man in states of hyperprolactinemia and acromegaly. No significant change related to elevated prolactin or growth hormone levels was detected. The above results suggest that, since PRLR is expressed by various lymphocyte sub-populations, the lymphocyte is a potential target for the action of PRL. However, the involvement of PRL in human or murine pathological settings requires further investigations. In the second phase, the potential role of PRL in the oncogenesis of breast cancer was investigated using two different approaches. Quantitative PCR was used to characterize the expression of PRLR messenger in mammary tissue from twenty-five women presenting with breast cancer or a benign disease of the breast. For each woman, mRNA expression in neoplastic tissue was compared with that in adjacent normal tissue. In all cases, a higher level of PRLR messenger expression was observed in the neoplastic tissue. In addition, the mammary synthesis of PRL was confirmed. These results suggest that neoplastic mammary cells may have enhanced sensitivity to PRL. In the rat, the 16 kDa fragment of PRL is a potent inhibitor of angiogenesis. We therefore addressed the possibility that cleavage of human PRL would yield anti­angiogenic fragments. The cleavage of human PRL was studied in various neoplastic and normal mammary cell extracts. Several fragments of variable mass ranging from 17 to 5 kDa were observed. N-terminal sequencing of those fragments, together with immunodepletion studies, enapled identification of cathepsin D as the protease involved in cleavage. An investigation to determine whether certain fragments have anti­ angiogenic potential is currently ongoing. In the course of the above studies, we have thus used or developed techniques involving enhanced characterization of PRLR expression in various systems. So doing has enabled us to more clearly elucidate the potential role of prolactin in various pathological conditions in humans.

keywords

• Endocrinologie
• Cancer du sein
• Néovascularisation
• Hormones -- Récepteurs
• Immunomodulation

Abstract

L'objectif de notre projet de recherche est de mieux comprendre l'implication de la prolactine dans Je système immunitaire murin et humain mais aussi dans la cancérogenèse mammaire humaine, en évaluant J 'expression du récepteur de la prolactine. Notre travail s'est donc scindé en deux parties. Dans une première partie nous avons caractérisé l'expression du récepteur de la prolactine dans le système immunitaire murin et humain. Nous avons d'une part réalisé cette caractérisation chez la souris et le rat, par cytométrie de flux, grâce à des anticorps dirigés contre le récepteur de la prolactine, et mis en évidence l'expression ubiquiste du récepteur dans différentes sous-populations lymphocytaires analysées. La prolactine étant impliquée dans la pathogénie du syndrome lupique chez la souris NZB, nous nous sommes intéressés à l'expression du RPRL dans ce modèle. Nous avons ainsi retrouvé une expression augmentant avec l'âge de la souris NZB, suggérant que chez cet animal, le RPRL peut participer au développement de la maladie. Nous avons d'autre part identifié, par RT-PCR, l'expression du messager du récepteur de la prolactine, dans le thymus, la moelle osseuse, la rate et les ganglions de souris et de rat. Nous avons aussi pu mettre en évidence que les messagers codant pour une forme courte et une forme longue du récepteur de la prolactine sont exprimés dans chacun de ces tissus. En outre, la mise en évidence d'une synthèse de prolactine dans le thymus de rat a permis d'identifier les lymphocytes comme une source extra-pituitaire de prolactine. Enfin, nous avons étudié l'expression du récepteur de la prolactine, chez l'homme, dans des situations d'hyperprolactinémie ou d'acromégalie, et nous n'avons pas retrouvé de modification significative liée aux taux élevés de prolactine ou d'hormone de croissance. L'ensemble de ces résultats nous permettent de penser que, le récepteur de la prolactine étant exprimé dans diverses populations lymphocytaires, la cellule lymphocytaire est potentiellement une cible de l'action de la prolactine. Cependant, l'implication de la prolactine dans des situations pathologiques humaine ou murine demande à être plus étudiée. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de la prolactine dans la cancérogenèse mammaire à travers deux approches différentes. Nous avons caractérisé l'expression du messager du récepteur de la prolactine par PCR quantitative, dans des tissus mammaires provenant de 25 femmes présentant un cancer du sein ou une pathologie mammaire bénigne. Nous avons pour chacune d'entre elles comparé l'expression de ce messager dans le tissu tumoral et le tissu normal adjacent. Nous avons toujours retrouvé une expression du récepteur plus importante dans le tissu tumoral comparativement au tissu normal, et avons aussi confirmé une synthèse mammaire de la prolactine. Ces résultats suggèrent que la cellule mammaire cancéreuse présente peut-être une sensibilité accrue à la prolactine. Chez le rat, le fragment de 16 kDa de la prolactine de rat est un puissant inhibiteur de l' angiogenèse. Nous nous sommes donc intéressés à l'éventualité d'un clivage de la PRL humaine et l'obtention de fragments aux actions anti-angiogéniques. Nous avons étudié le clivage de la PRL humaine par des extraits de cellules mammaires tumorales ou normales et observé plusieurs fragments de taille variable, allant de 17 à 5 kDa. Le séquençage N-terminal de ces fragments, ainsi que des expériences d'immunodéplétion, nous permettent d'identifier la cathepsine D comme étant la protéase impliquée dans ce clivage. L'analyse de l'éventuelle action, anti-angiogénique, de certains de ces fragments est actuellement en cours. A travers ces approches, nous avons donc utilisé ou mis au point des techniques qui nous permettent de mieux caractériser l'expression du récepteur de la prolactine dans différents systèmes, nous aidant à mieux comprendre l'éventuelle implication de la prolactine dans diverses situations pathologiques humaines.