Replication par le mecanisme du cercle roulant du plasmide pgt5, un plasmide decouvert chez l'archaebacterie hyperthermophile pyrococcus abyssi

Rolling circle replication of the plasmid pgt5 from the hyperthermophilic archaeon pyrococcus abyssi

• Auteur / Autrice : Stéphanie Marsin
• Direction : Patrick Forterre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1998
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Les plasmides sont des elements extra-chromosomiques qui se repliquent et se regulent de facon autonomes dans les cellules hotes. Ils sont connus et etudies depuis longtemps chez les eubacteries ou ils ont ete utilises, tout comme les phages, comme modeles pour l'etude de la replication de l'adn. Chez les archaebacteries hyperthermophiles, les connaissances concernant la replication sont encore limitees, et l'absence actuelle d'outils genetiques ne favorise pas l'avance des recherches. Le plasmide pgt5, isole de pyrococcus abyssi, a ete le premier etudie chez ce type d'organisme. Il a ete sequence et nous avons pu montre qu'il se repliquait par le mecanisme du cercle roulant. La proteine initiatrice de sa replication, rep75, a ete surproduite chez escherichia coli et etudiee in vitro. Entre 75c et 105c, rep75 est capable de couper et religuer un oligonucleotide simple brin portant le site de coupure de pgt5, ainsi que de relacher un plasmide surenroule negativement. Lors de cette etude, nous avons egalement mis en evidence une activite site specifique, de type nucleotidyl terminale transferase, qui n'avait jamais ete decrite pour d'autres proteines rep. Entre 55c et 105c, rep75 est en effet capable de transferer, a partir de l'atp (ou du datp), un nucleotide sur l'extremite 3' hydroxyle du site de coupure. Par mutagenese dirigee, nous avons pu identifier le site actif de rep75 et montre qu'il etait implique dans toutes les activites de rep75. Cette meme analyse a permis cependant de dedoubler les activites de coupure et de transfert, et de montrer que differents mecanismes etaient en jeu. Nous avons egalement remarque que la presence de (d)atp inhibait les activites de coupure religation, et nous proposons un nouveau mecanisme de regulation dans le quel l'activite nucleotidyl terminale transferase inactive la proteine rep75 au cours de la replication du plasmide.