Imagerie par fluorescence à différentes échelles de Pseudomonas aeruginosa : de la morphogenèse cellulaire à la resensibilisation aux antibiotiques

Multiscale fluorescence imaging of Pseudomonas aeruginosa : from cell morphogenesis to antibiotic resensitization

• Auteur / Autrice : Merve Nur Tunç
• Direction : Rut Carballido lopez, Romain Briandet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 07/07/2025
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Christophe Beloin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ina Attree, Emmanuelle De, Romain Mercier, Florie Desriac
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ina Attree, Emmanuelle De

Mots clés

Mots clés contrôlés

Imagerie

Microscopie

Protéine MreB

Ivacaftor

Colistine

Pseudomonas aeruginosa

Mots clés libres

Pseudomonas aeruginosa

Colistine

Ivacaftor

MreB

Imagerie

Pseudomonas aeruginosa

Colistin

Ivacaftor

MreB

Imaging

Résumé

La bactérie à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa est l'un des pathogènes opportunistes les plus préoccupants en milieu hospitalier. Sa résistance croissante aux antibiotiques constitue une menace majeure pour les efforts mondiaux de lutte contre les infections. Dans ce travail, des approches d'imagerie par fluorescence à différentes échelles ont été mises en œuvre pour étudier P. aeruginosa, tant au niveau unicellulaire qu'au sein de biofilms. Ces approches ont été combinées à des outils génétiques, à l'interférence par CRISPRi, à la cytométrie en flux et électronique, à des analyses transcriptomiques et à des tests de motilité, afin d'examiner deux processus associés à la surface cellulaire essentiels à la viabilité de P. aeruginosa. Dans un premier temps, l'étude s'est concentrée sur le rôle des protéines morphogénétiques de type actine MreBCD chez P. aeruginosa. Nos résultats montrent que l'actine bactérienne MreB est cruciale pour le maintien de la forme en bâtonnet, la motilité, l'organisation des biofilms et la modulation de la sensibilité aux antibiotiques β-lactamines, bien qu'elle ne soit pas indispensable à la viabilité de P. aeruginosa. En revanche, les protéines MreC et MreD se sont révélées essentielles, tant pour la viabilité cellulaire que pour la morphogénèse. La deuxième partie de l'étude a porté sur la resensibilisation de P. aeruginosa à la colistine, un antibiotique de dernier recours appartenant à la famille des peptides antimicrobiens cationiques ciblant les lipopolysaccharides de la membrane externe. L'ivacaftor, une petite molécule approuvée en clinique pour le traitement de la mucoviscidose, s'est avérée restaurer l'efficacité de la colistine contre des souches résistantes. Cette synergique a été observé aussi bien chez les cellules planctoniques que dans les biofilms de P. aeruginosa, y compris sur des cellules cultivées sur des épithéliums bronchiques humains primaires, mimant une infection pulmonaire. Un effet synergique comparable a également été observé chez Klebsiella pneumoniae et Escherichia coli. Les mécanismes sous-jacents à cette synergie colistine-ivacaftor ont été explorés par une analyse transcriptomique (RNA-seq), permettant d'identifier plusieurs gènes candidats étudiés plus en détail.

The Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa is one of the most clinically relevant opportunistic pathogens in healthcare settings. Its rising antibiotic resistance presents a growing threat to infection control efforts worldwide. In this work, multiscale fluorescence-based imaging techniques were implemented to study P. aeruginosa at both the single-cell and biofilm levels, and combined with genetics, CRISPRi, flow cytometry, and electron microscopy, transcriptomics and motility assays to study two cell surface-associated processes essential for P. aeruginosa viability. The first part of the study focused on the role of the morphogenetic proteins MreBCD in P. aeruginosa. We demonstrated that bacterial actin MreB is crucial for maintaining rod shape, motility, structuring biofilms and modulating susceptibility to β-lactam antibiotics, but is dispensable for viability in P. aeruginosa. In contrast, mreCD is essential for both cell viability and rod shape. The second part of the study focused on resensitising P. aeruginosa to the last-resort antibiotic colistin, a cationic antimicrobial peptide targeting the outer membrane. Ivacaftor, a clinically approved small molecule for cystic fibrosis therapy, was shown to restore the efficacy of colistin in resistant strains. This synergistic effect was demonstrated in both planktonic and biofilm-forming P. aeruginosa cells, as well as cells grown on primary human bronchial epithelia, mimicking lung infection conditions. The synergistic effect was also shown in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli. The mechanisms underlying colistin-ivacaftor synergistic antibacterial action were next explored using a transcriptomic (RNA-seq) analysis, and several candidate genes were further investigated. Together, this PhD work highlights the bacterial cell envelope as a critical vulnerability and the relevance of new therapeutic strategies to combat multidrug-resistant Gram-negative pathogens.