Exploration du rôle des protéines du thylakoïde, Ape1 et Tlp15, chez la cyanobactérie, Synechocystis sp. PCC6803

Exploring the role of the conserved thylakoid proteins, Ape1 and Tlp15, in the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC6803

• Auteur / Autrice : Pathomchai Dindaeng
• Direction : Corinne Cassier-Chauvat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies
• Date : Soutenance le 05/02/2025
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Fabrice Confalonieri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alix Boulouis, José Manuel García-Fernández, Xenie Johnson
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alix Boulouis, José Manuel García-Fernández

Mots clés

Mots clés contrôlés

Espèces réactives de l'oxygène

Synechocystis

Stress oxydatif

Thylakoïdes

Acclimatation

Photosynthèse

Mots clés libres

Acclimatation

Photosynthèse

Thylakoïde

Ape1

Tlp15

Synechocystis

Stress oxydatif

Acclimation

Photosynthesis

Ape1

Tlp15

Synechocystis

Oxidative stress

Résumé

La photosynthèse oxygénique est bien conservée, des cyanobactéries aux organismes contenant des chloroplastes, tels que les algues et les plantes. Utilisant l'énergie de la lumière, le dioxyde de carbone (CO₂), les minéraux et l'eau, les organismes photosynthétiques assimilent une grande quantité de carbone et d'azote inorganiques pour générer leur biomasse, qui est ensuite distribuée aux organismes hétérotrophes, suggérant qu'ils constituent la base de la chaîne alimentaire. Cependant, ce mécanisme peut produire des espèces réactives de l'oxygène (ROS), qui causent des dommages irréversibles aux protéines à l'appareil photosynthétique, puis réduisant l'efficacité de la photosynthèse. Les organismes photosynthétiques ont donc développé des processus pour diminuer aux ROS générés par la photosynthèse. L'un d'entre eux, appelé acclimatation, permet d'ajuster la composition de l'appareil photosynthétique afin de le rendre tolérant aux conditions fluctuantes. Deux protéines trouvées dans les membranes photosynthétiques à savoir i) d'Acclimatation de la Photosynthèse à l'Environnement 1 (Ape1) et ii) Protéine Luminale Thylakoïdienne 15 (Tlp15), sont conservées et, grâce au criblage génétique, ont été considérées comme impliquées dans le processus d'acclimatation chez la microalgue Chlamydomonas reinhardii et la plante Arabidopsis thaliana. Cependant, le rôle de ces protéines reste inconnu et n'a jamais été étudié chez les cyanobactéries, qui ont développé la photosynthèse oxygénique et sont considérées comme i) l'ancêtre des chloroplastes et ii) cellulaires potentielles pour la production durable de molécules pour la santé et l'énergie. L'objectif de cette thèse est d'analyser le rôle d'Ape1 (Slr0575) et de Tlp15 (Sll1071) chez le modèle cyanobactérien, Synechocystis sp. PCC 6803, qui est génétiquement manipulable et capable de croître en l'absence de photosynthèse grâce au glucose. Tout d'abord, des mutants à délétion des gènes codant ces deux protéines ont été construits en remplaçant par une cassette de résistance aux antibiotiques dans toutes les copies chromosomiques de Synechocystis. Les gènes ape1 et tlp15 sont trouvés dispensables dans les conditions de croissance photoautotrophiques standard. Ensuite, les phénotypes des mutants ont été analysés par des méthodes (croissance dans diverses conditions environnementales et de stress, mesures de l'évolution de l'O₂, tests enzymatiques, quantification des métabolites de certaines molécules carbonées, etc.). Le mutant Δape1 s'est révélé sensible au stress oxydatif (le peroxyde d'hydrogène et la ménadione) et produit plus de ROS que la souche sauvage (WT), suggérant que la protéine Ape1 est impliquée dans la tolérance au stress oxydatif. Le mutant Δtlp15 croît comme la souche WT dans des conditions photoautotrophiques sous diverses intensités lumineuses, mais produit moins d'O₂ que la WT. De manière surprenante, en présence de glucose (conditions mixotrophiques) sous une forte lumière qui favorise le stress oxydatif et la production de méthylglyoxal, le mutant Δtlp15 est capable de croître mais la souche WT ne l'est pas. Ce phénotype est dû à l'absence de tlp15, pas de mutation secondaire, puisque l'introduction du gène tlp15 (complémentation) dans le mutant Δtlp15 rétablit le phénotype WT. Le mutant Δtlp15 s'est également révélé plus tolérant à divers stress oxydatifs et capable de réorganiser les voies du métabolisme du carbone différemment de la souche WT. Une analyse structure-fonction a été réalisée en utilisant la mutagenèse dirigée. Le domaine transmembranaire de Tlp15 et les deux cystéines impliquées dans la formation d'un pont disulfure se sont révélés impliqués dans l'activité de Tlp15. Tous ces résultats suggèrent que Tlp15 participe à un mécanisme de régulation redox impliqué dans le processus d'acclimatation de la photosynthèse. Un modèle intégrant l'ensemble des résultats est proposé.

Oxygenic photosynthesis is well-conserved from cyanobacteria to chloroplast-containing organisms such as algae and plants. Using energy from light, carbon dioxide (CO₂), minerals and water, the photosynthetic organisms assimilate a large number of inorganic carbon and nitrogen to generate their biomass to be distributed to the heterotrophic organisms suggesting that they are the base of the food chain. However, the mechanism can lead to the formation of Reactive Oxygen Species (ROS) which causes irreversible damages on proteins, lipids, DNA and photosynthetic apparatus thus decreasing the photosynthesis efficiency. Therefore, photosynthetic organisms had developed various processes to deal with ROS generated directly or indirectly from photosynthesis. Some of them are conserved through the evolution of the green lineage. One of these, named the acclimation, allows adjusting the composition of photosynthetic apparatus in the thylakoid membrane to make them tolerant to fluctuating conditions. Two proteins found in thylakoids, the photosynthetic membranes, i) the Acclimation of Photosynthesis to the Environment 1 protein (Ape1) and the Thylakoid Luminal Protein 15 (TLP15) are conserved through the green lineage and thanks to genetic screening, they were considered to be involved in the acclimation process in the microalga, Chlamydomonas reinhardii, and the plant, Arabidopsis. However, the role of these proteins remained unknown and was never been studied in cyanobacteria that have evolved oxygenic photosynthesis and are considered as i) the ancestor of the chloroplast of eukaryotic photosynthetic organisms, ii) potential cell factories for sustainable production of high added values molecules for health and energy. The objective of this thesis is to analyze the role of Ape1 (Slr0575) and Tlp15 (Sll1071) in the model cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803 that is genetically manipulable and is able to grow in the absence of photosynthesis at the expense of glucose. First, single knockout mutants of the genes encoding the two proteins were constructed by replacing their corresponding genes with an antibiotic resistance cassette in all chromosome copies of Synechocystis. ape1 and tlp15 genes were shown to be dispensable in standard photoautotrophic growth. Then the mutant phenotypes were analyzed by a combination of methods (growth in various environmental and stress conditions, O₂ evolution measurements, enzymatic assays, metabolites quantification of some carbonated molecules, etc..). The Δape1 mutant was shown to be sensitive to oxidative stress induced by hydrogen peroxide and menadione and produces more ROS than the wild-type strain (WT) suggesting that APE1 protein is involved in the tolerance to oxidative stress. The Δtlp15 mutant grows as the WT strain in photoautotrophic conditions under various light intensities but produce less O₂ than the WT. Surprisingly, in the presence of glucose (mixotrophic conditions) under high light that promote oxidative stress and methylglyoxal production, the Δtlp15 is able to grow whereas the WT strain is not. This phenotype is due to the absence of tlp15 and not to a secondary mutation since the introduction of tlp15 gene (complementation) in the Δtlp15 restores the WT phenotype. The Δtlp15 mutant was also shown to be more tolerant to various oxidative stresses and is able to reorganize carbon metabolism pathways differently than the WT. A structure function analysis was performed using site-directed mutagenesis. The transmembrane domain of Tlp15 as well as the two cysteines involved in the formation of a disulfide bridge were shown to be involved in the activity of Tlp15. All these results suggest that Tlp15 participates in a redox regulation mechanism involved in photosynthesis acclimation process. A model taking into account all the results is proposed.