Nanoformulations d'agents antioxydants à visée ophtalmique pour la prévention de la dégénérescence maculaire liée à l'âge

Nanoformulations of antioxidant active ingredients for ophthalmic administration in the prevention of age-related macular degeneration

• Auteur / Autrice : Mitta Pierre
• Direction : Christine Charrueau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacochimie
• Date : Soutenance le 01/10/2025
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Harold Merle
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurent Kodjikian, Françoise Brignole-Baudouin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alexandra Miere, Nicolas Anton

Mots clés

Mots clés contrôlés

Médicaments ophtalmiques

Dégénérescence maculaire liée à l'âge

Stress oxydatif

Voie topique

Antioxydants

Liposomes

Mots clés libres

Nanoformulation ophtalmique

Liposome

Voie topique

Formule AREDS

Antioxydant

Stress oxydatif

Dégénérescence maculaire liée à l'âge

Dmla

Ophthalmic nanoformulation

Liposome

Topical route

AREDS formula

Antioxidant

Oxidative stress

Age-Related macular degeneration

Amd

Résumé

Introduction : la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie rétinienne cécitante où la dysrégulation du stress oxydatif joue un rôle majeur. L'étude AREDS (Age-Related Eye Disease Study), vaste essai clinique prospectif multicentrique, a démontré l'efficacité d'une supplémentation orale à fortes doses d'agents antioxydants (vitamine C, zinc, vitamine E et bêta-carotène) dans la prévention des formes sévères de DMLA. L'apport chronique de ces micronutriments à fortes doses peut entraîner des effets indésirables systémiques. La cible thérapeutique étant la rétine, une administration oculaire pourrait permettre de réduire la dose de principes actifs nécessaire et limiter les effets indésirables systémiques. Compte tenu du caractère préventif, une administration non invasive par une voie topique représente une alternative intéressante. Objectif : dans ce contexte, l'objectif principal était de développer, caractériser, et évaluer biologiquement des liposomes co-encapsulant les principes actifs (PA) antioxydants hydrophiles (33,4mM de vitamine C et 5,0mM de zinc) et lipophiles (6,8mM de vitamine E et 0,67mM de bêta-carotène) de la formule AREDS, pour une administration ophtalmique topique. Matériels et méthodes : de la phosphatidylcholine de soja (PCS) et du TPGS (succinate de tocophérol polyéthylène glycol 1000) ont été utilisés pour la fabrication des liposomes par la méthode d'hydratation du film lipidique suivie d'une étape d'extrusion séquentielle. Leur caractérisation comprenait des mesures du pH, de l'osmolalité, du diamètre, de l'indice de polydispersité (PDI), du potentiel zêta, de la concentration en liposomes, et une observation morphologique par microscopie électronique à transmission. La stabilité des nanoformulations a été suivie durant 6 mois. La cytotoxicité in vitro des PA, des excipients et des nanoformulations a été évaluée sur des cellules épithéliales cornéennes (HCE-T) et rétiniennes (ARPE-19). L'activité antioxydante in vitro des formulations a été évaluée en utilisant du TPGS et de l'antimycine A (50µM) comme inducteurs de stress oxydatif sur les cellules ARPE-19. Résultats : des liposomes sphériques et unilamellaires à base de 100mM de PCS seule, ou associée à du TPGS (0,5mM ou 12,5mM) ont permis de co-encapsuler les 4 PA. Le pH a été ajusté à 6,3+/-0,06 avec de la L-lysine et l'osmolalité à 297+/-18mOsm/kg avec du NaCl 0,7%. Les liposomes étaient de charge neutre et leur diamètre moyen (116+/-9nm) est resté stable à 3 mois, avec un PDI moyen <0,2. Au niveau cornéen, le mélange des 4 PA formulés ou non en liposomes présentaient plus de 50% de cytotoxicité in vitro. Au niveau rétinien, la cytotoxicité des formulations liposomales croissait avec la teneur initiale en TPGS (<35% sans TPGS, 40 à 50% avec 0,5mM, >65% avec 12,5mM). En présence de 50µM de TPGS ou d'antimycine A, les suspensions liposomales encapsulant tous les PA permettaient une réduction de 0,3+/-1,3% et de 33+/-8% de la mortalité cellulaire, respectivement. Parmi les PA formulés et testés séparément, seule la vitamine E a significativement réduit la mortalité cellulaire (jusqu'à 24% et 38%, respectivement). Discussion : selon ces résultats, l'adaptation ophtalmique de la formule AREDS ne serait pas administrable par voie topique en raison de sa cytotoxicité in vitro sur les cellules cornéennes. De plus, l'effet synergique de ce mélange d'antioxydants n'a pas été retrouvé sur le stress oxydatif induit in vitro par le TPGS ou par l'antimycine A sur les cellules rétiniennes. L'effet antioxydant observé semblait uniquement lié à la vitamine E, seul composé de cette formule ayant réduit significativement la cytotoxicité in vitro du TPGS et de l'antimycine A sur les cellules ARPE-19. Conclusion : des liposomes à visée ophtalmique encapsulant uniquement de la vitamine E représentent donc une alternative potentielle aux supplémentations orales pour la prévention de dommages rétiniens dus au stress oxydatif.

Introduction: age-related macular degeneration (AMD) is a blinding retinal disease where the dysregulation of oxidative stress plays a major role. The Age-Related Eye Disease Study (AREDS), a large prospective multicenter study, provided proof of the effectiveness of oral supplementations with high doses of antioxidants (vitamin C, zinc, vitamin E and beta-carotene) in preventing severe forms of AMD. However, the chronic intake of these micronutrients in high doses can generate systemic adverse effects. The therapeutic target being the retina, ocular routes of administration could reduce the required dosage of active ingredients and limit systemic adverse effects. Given the preventive nature of this therapy, a non-invasive administration by a topical route represents a noteworthy alternative. Objective: in this context, our main aim was to develop, to characterize, and to biologically assess liposomes co-encapsulating the hydrophilic (33.4mM vitamin C and 5.0mM zinc) and lipophilic (6.8mM vitamin E and 0.67mM beta-carotene) antioxidant active pharmaceutical ingredients (APIs) of the AREDS formula, for topical ophthalmic use. Material and methods: soybean phosphatidylcholine (SPC) and TPGS (Tocopheryl Polyethylene Glycol 1000 Succinate) were used for the liposomes' preparation by the thin lipid film hydration method followed by sequential extrusion. Their characterization included measurement of pH, osmolality, mean diameter, polydispersity index (PDI), zeta potential, concentration of liposomes, and morphological observation by transmission electron microscopy. The stability of the nanoformulations was followed over 6 months. The in vitro cytotoxicity of the APIs, excipients and liposomal formulations was assessed on corneal epithelial cells (HCE-T) and retinal epithelial cells (ARPE-19). The in vitro antioxidant activity of the formulations was also evaluated by using TPGS and antimycin A (50µM) as oxidative stress inducers on ARPE-19 cells. Results: spherical and unilamellar liposomes containing 100mM SPC alone or associated with TPGS (0.5mM or 12.5mM) allowed to co-encapsulate the 4 APIs. The pH was adjusted to 6.3+/-0.06 with L-lysine, and osmolality to 297+/-18mOsm/Kg with NaCl 0.7%. The liposomes were electrically neutral, and their mean diameter (116+/-9nm) remained stable at 3 months follow-up, with a mean PDI <0.2. The mixture of the 4 APIs formulated or not into liposomes exhibited more than 50% in vitro cytotoxicity on the corneal cells. On the retinal cells, the in vitro cytotoxicity of the liposomal formulations increased according to the initial TPGS content (<35% without TPGS, 40 to 50% with 0.5mM, >65% with 12.5mM). In the presence of 50µm TPGS or antimycin A, the liposomal suspensions encapsulating all the APIs respectively reduced cell mortality by 0.3+/-1.3% and 33+/-8%. Among the APIs formulated and tested separately, only the vitamin E significantly reduced cell mortality (up to 24% and 38%, respectively). Discussion: according to these results, the ophthalmic adaptation of the AREDS formula may not be usable by the topical route because of its in vitro cytotoxicity on corneal cells (HCE-T). Moreover, the synergetic effect of this cocktail of antioxidant agents was not observed on the oxidative stress induced in vitro by TPGS or antimycin A on retinal cells (ARPE-19). The observed antioxidant effect seemed to be solely driven by the presence of vitamin E, the only compound of this formula that significantly reduced the in vitro cytotoxicity of TPGS and antimycin A on ARPE-19 cells. Conclusion: liposomes for ophthalmic use encapsulating vitamin E are a potential alternative to oral supplementations for the prevention of retinal damages due to oxidative stress.