Physiopathologie des pneumopathies interstitielles diffuses pédiatriques d'origine génétique ou supposée génétique

Pathophysiology of Pediatric Diffuse Interstitial Lung Diseases of Genetic or Presumed Genetic Origin

• Auteur / Autrice : Yohan Soreze
• Direction : Nadia Moulin Nathan, Sonia-Athina Karabina
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Soutenance le 26/05/2025
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiopathologie des maladies génétiques d'expression pédiatrique (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Harriet Corvol
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre-Henri Jarreau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Cottin, Arnaud Mailleux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutation (biologie)

Maladies rares

Enfants malades

Fibrose pulmonaire

Pneumopathie infiltrante diffuse

Mots clés libres

Surfactant

Fibrose pulmonaire

Pneumopathie interstitielle diffuse

Gene mutations

Surfactant

Pulmonary fibrosis

Interstitial lung disease

Gene mutations

Résumé

Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID) de l'enfant sont un groupe hétérogène de pathologies rares et sévères pouvant survenir de la période néonatale jusqu'à l'âge adulte. Les étiologies sont multiples et incluent entre autres les anomalies des protéines du surfactant, ou l'hyperplasie des cellules neuroendocrines du nourrisson (NEHI). Le but de ce travail était de progresser dans la compréhension physiopathologique de deux PID liées au métabolisme du surfactant et de rechercher des pistes moléculaires dans les NEHI. La première partie a porté sur l'étude du variant V178M dans SFTPA1 et SFTPA2, identifié chez des patients atteints de PID et de cancers pulmonaires. Ces gènes codent pour la protéine du surfactant (SP)-A qui joue un rôle majeur dans l'homéostasie alvéolaire. Dans des cellules A549, des plasmides exprimant SP-A wild-type (WT) ou V178M ont été transfectés. L'étude par western blot a confirmé que l'expression protéique était conservée après transfection avec V178M. Dans un modèle de scratch mimant des lésions alvéolaires, une différence de réparation cellulaire après transfection avec V178M, et une mortalité plus importante ont été observées. L'étude par immunofluorescence avec l'anticorps anti PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) a montré une diminution de la prolifération cellulaire après transfection avec le variant. Nous avons montré que le taux d'IL-8 mesuré par ELISA était plus élevé dans le surnageant des cellules transfectées avec V178M par rapport au WT. Enfin, le traitement par dexaméthasone des cellules exprimant V178M entraînait une diminution du taux d'IL-8 et de la mortalité par rapport aux cellules non traitées. Cette étude confirme l'effet délétère du variant V178M de SP-A sur la prolifération et la mortalité cellulaires et a permis de mettre en évidence les mécanismes liés à un effet bénéfique de la corticothérapie. La deuxième partie du travail portait sur l'étude de 3 variants dans le gène NKX2.1 (Y214C, R165W et G147A) associés à des formes respiratoires létales de syndrome cerveau-poumon-thyroïde chez des nourrissons. Nous avons montré par western blot une expression protéique diminuée des deux variants R165W et Y214C, par rapport au WT et à G147A. La localisation nucléaire de la protéine NKX2.1 n'était pas affectée par les variants (immunofluorescence). Sur les pièces de biopsie pulmonaire de la patiente présentant le variant Y214C, l'expression de SP-C et de pro-SPC par rapport à un poumon témoin était absente. Enfin, les essais luciférase ont montré que le variant Y214C n'entraînait la transactivation d'aucun des promoteurs testés (SFTPB, SFTPC, thyroglobuline et thyroperoxydase), le variant R165W entraînait soit une augmentation soit une perte de de fonction des différents promoteurs. Le variant G147A se comportait comme le WT avec une transactivation similaire de tous les promoteurs testés. Ainsi, notre étude a permis d'affirmer et de préciser la pathogénicité des variants Y214C et R165W situés dans l'homéodomaine de NKX2.1 et, à ce stade, d'infirmer cette du variant G147A. La troisième partie du travail a porté sur l'étude génomique d'une cohorte de 20 patients atteints de NEHI. Il s'agissait d'une analyse de génomes entiers en trio des patients et de leurs deux parents. Nous avons d'abord identifié 4 gènes candidats (CMTR1, COL15A1, COLEC12, SRPK2) chez 4 patients différents parmi lesquels deux n'ont pas été retenus. En modifiant les filtres d'analyse, le gène SRRM2 a retenu notre attention puisqu'il a été identifié chez deux patients indépendants et qu'il est déjà connu pour être associé à un retard du neurodéveloppement. Au total, plusieurs éléments liés à la génétique des maladies respiratoires rares ont été étudiés. Des thérapeutiques ciblées pour les patients porteurs de variants SFTPA1 /SFTPA2, des corrélations phénotype-génotype pour les patients porteurs de variants NKX2.1, et de nouvelles pistes moléculaires dans les NEHI ont été envisagées.

Interstitial Lung Diseases (ILD) in children are a heterogeneous group of rare and severe diseases that can occur from the neonatal period to adulthood. The aetiologies are numerous and include, among others, abnormalities in surfactant proteins or neuroendocrine cell hyperplasia of infancy (NEHI). This work aimed to advance the understanding of the pathophysiology of two surfactant-related ILDs and to explore molecular pathways in NEHI.The first part focused on the variant V178M in the SFTPA1 and SFTPA2 genes, identified in patients with ILD and lung cancers. These genes code for the surfactant protein (SP)-A, which plays a major role in alveolar homeostasis. In A549 cells, plasmids expressing either the wild-type (WT) SP-A protein or the variant V178M were transfected. Western blot analysis confirmed that protein expression was preserved after transfection with V178M. In a scratch model mimicking alveolar lesions, a difference in cell repair after transfection with V178M and increased mortality were observed. Immunofluorescence studies using the anti-PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) antibody showed a decrease in cell proliferation following transfection with the variant. We demonstrated that the level of IL-8 measured by ELISA was significantly higher in the supernatant of cells transfected with V178M compared to WT. Finally, treatment of cells with dexamethasone after transfection with V178M resulted in a significant reduction in IL-8 levels and mortality compared to untreated cells. This study confirms the deleterious effect of the SP-A variant V178M on cell proliferation and mortality and highlights mechanisms related to the beneficial effects of corticosteroid therapy.The second part of the work focused on the study of three variants in the NKX2.1 gene (Y214C, R165W, and G147A) associated with lethal respiratory phenotypes of brain-lung-thyroid syndrome in infants. We showed through western blot that the protein expression of the variants R165W and Y214C was significantly lower compared to WT and G147A. The nuclear localization of NKX2.1 protein was not affected by the variants (immunofluorescence). In lung biopsy specimens from the patient with the Y214C variant, there was a complete absence of expression of the surfactant protein SP-C and its precursor pro-SPC compared to a control. Finally, luciferase assays demonstrated that the Y214C variant did not activate any of the tested promoters (SFTPB, SFTPC, thyroglobulin, and thyroperoxydase), while the R165W variant either increased or decreased the function of the various promoters. The G147A variant behaved like the WT with similar transactivation of all tested promoters. Thus, our study allowed us to affirm and clarify the pathogenicity of the variants Y214C and R165W, located in the homeodomain of NKX2.1 and at this stage to rule out that of the G147A variant.The third part of the work involved the genomic study of a cohort of 20 patients with NEHI. This was a trio-based whole genome analysis of the patients and their two parents. We initially identified four candidate genes (CMTR1, COL15A1, COLEC12, SRPK2) in four independent patients, of which two were discarded. By modifying the analysis filters, the SRRM2 gene caught our attention as it was identified in two independent patients and is already known to be associated with neurodevelopmental disorders.Overall, several elements related to the genetics of rare respiratory diseases were studied. Targeted therapies for patients carrying SFTPA1/SFTPA2 variants, phenotype-genotype correlations for patients with NKX2.1 variants, and new molecular pathways in NEHI were considered.