Développer des outils bioinformatique pour reconstruire l'activité spatio-temporelle tridimensionnelle des enhancers au cours de l'embryogenèse de Drosophila melanogaster

Develop bioinformatic tools to reconstruct the three-dimensional spatio-temporal activity of enhancers during Drosophila melanogaster embryogenesis

• Auteur / Autrice : Baptiste Alberti
• Direction : Yad Ghavi-Helm
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement
• Date : Soutenance le 05/11/2025
• Etablissement(s) : Lyon, École normale supérieure
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon (Lyon ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Marie Sémon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yad Ghavi-Helm, Robin Andersson, Anamaria Necsulea, Arnau Sebé-Pedros, Olivier Gandrillon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Robin Andersson, Anamaria Necsulea

Mots clés

Mots clés contrôlés

Analyse de l'expression du gène de la cellule unique

Éléments activateurs (génétique)

Embryologie

Transcriptomique

ADN non codant

Mots clés libres

Enhancer

ScRNA-Seq

Transport Optimal

Embryogénèse

Reconstruction Spatiale

Enhancer

ScRNA-Seq

Optimal Transport

Embryogenesis

Spatial Reconstruction

Résumé

La régulation de l'expression des gènes au niveau transcriptionnel joue un rôle central dans la détermination du destin cellulaire et du développement en général. Les modules cis-régulateurs (CRMs) modulent cette expression en réponse à des signaux biologiques ou environnementaux. Ma thèse se concentre sur un type particulier de CRM : les enhancers, éléments d'ADN non codants régulant l'expression de leurs gènes cibles avec une grande précision spatiale et temporelle. Mon objectif était de développer une méthode pour cartographier cette activité à l'échelle de la cellule unique pour une multitude d'enhancers. En effet, bien que les avancées technologiques récentes aient amélioré la capacité à prédire la localisation des enhancers dans les génomes, leur activité spatiale et temporelle reste difficile à identifier car les tests d'activité des enhancers actuels souffrent soit d'un manque de débit, soit d'une résolution spatiale et temporelle insuffisante. Pour y remédier, nous avons développé spatial-scERA, une méthode combinant le séquençage d'ARN en cellule unique (scRNA-seq) avec des tests en parallèles d'activité d'enhancers et une reconstruction spatiale. Notre approche repose sur le transport optimal pour positionner les cellules des données scRNA-seq dans une reconstruction virtuelle de l'embryon en intégrant les profils transcriptomiques de ces cellules avec des connaissances a priori sur l'expression d'un ensemble de gènes marqueurs. Cela permet de cartographier l'activité des enhancers dans un tissu virtuel 3D reconstruit avec une résolution cellulaire. Nous avons utilisé spatial-scERA avec 25 enhancers candidats pour reconstruire leur activité dans un embryon virtuel de Drosophila au stade 6. Notre jeu de données inclut à la fois des enhancers déjà caractérisés et d'autres non annotés, permettant d'évaluer la robustesse de notre approche tout en identifiant de nouveaux éléments régulateurs. Comparée à des acquisitions d'HCR in situ, spatial-scERA reconstruit fidèlement l'activité de nos enhancers, y compris pour ceux détectés dans seulement 10 cellules dans les données scRNA-seq. Nous avons également montré que l'intégration des données spatiales permet de prédire les gènes cibles des enhancers et d'améliorer l'annotation des clusters scRNA-seq, permettant ainsi une identification plus précise des types cellulaires. Pour étendre notre méthode à d'autres stades de développement, nous avons généré et analysé des données scRNA-seq contenant les 25 mêmes enhancers aux stades 8 et 11. Nous avons d'abord étudié la dynamique d'activité des enhancers à partir des données scRNA-seq uniquement, en nous concentrant sur l'observation des variations de la spécificité tissulaire aux travers des 3 stades disponibles. Cependant, nous manquons actuellement d'un atlas 3D de l'expression des gènes marqueurs aux stades 8 et 11 pour produire une reconstruction. Pour générer cet atlas, nous développons la transcriptomique spatiale basée sur l'imagerie en utilisant la technologie MERFISH développé par Spatial-Cell-ID. Une fois que ces données seront disponibles, nous pourrons générer nos propres reconstructions à différents stades, et ainsi projeter nos enhancers des données scRNA-seq vers leurs positions spatiales dans un embryon. Notre approche, offre un cadre puissant pour cartographier l'évolution spatio-temporelle de l'activité des enhancers. Applicable à tout organisme compatible avec des tests d'activité des enhancers et du scRNA-seq, notre méthode offre de nouvelles perspectives sur l'étude de la régulation des gènes dans les systèmes multicellulaires complexes.

The regulation of gene expression at the transcriptomic level plays a central role in cell fate determination and development. Key regulatory elements, known as cis-regulatory modules (CRMs), fine-tune gene expression in response to biological cues or environmental signals. My thesis focused on one type of CRM: enhancers, which are non-coding DNA elements that regulate their target gene expression in a precise spatial and temporal manner. My aim was to develop a method to map this activity at the single-cell level in a scalable manner. Indeed, recent technological advances have improved the ability to predict the location of enhancers, but identifying their spatial and temporal activity remains challenging. Current enhancer-reporter assays either lack throughput or fail to capture spatial and temporal resolution.To address this, we developed spatial-scERA, a method that combines parallel enhancer-reporter assays with single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and spatial reconstruction. Our approach leverages optimal transport to position the cells from a scRNA-seq experiment in a virtual reconstruction of the embryo by integrating the transcriptomic profiles of these cells with a priori knowledge on the expression of a set of marker genes. This enables enhancer activity to be mapped in a reconstructed 3D virtual tissue at single-cell resolution.To validate spatial-scERA, we applied it to predict the spatial activity of 25 candidate enhancers in a stage 6 Drosophila embryo. Our dataset included both well-characterized and unannotated enhancers, allowing us to assess the method's accuracy while uncovering new regulatory elements and their activity. By systematically comparing our reconstructions with HCR in-situ imaging, we confirmed that spatial-scERA accurately reconstructs enhancer activity patterns, even for enhancers whose sequence was recovered in as few as 10 cells in the scRNA-seq experiment. We further showed that integrating spatial information allows for enhancer target gene predictions and improves scRNA-seq cluster annotation, enabling more precise cell-type identification.To extend our method to other developmental stages, we further generated and analyzed spatial-scERA datasets from stages 8 and 11 of Drosophila embryogenesis, tracking the same 25 enhancers across development. We first investigated the dynamics of enhancer activity across cell types and stages from scRNA seq alone, focusing on observing tissue-specificity variations across stages. However, in order to generate 3D reconstructions of the enhancers' activity, we currently lack a 3D atlas of markers genes expression at these stages. To generate this atlas, we are developing image-based spatial transcriptomics using the MERFISH technology at the Spatial-Cell-ID facility. Once this data will be available, we will be able to generate our own reconstructions at different stages, and thus, project our enhancer from scRNA-seq to spatial position in an embryo.Overall, our approach provides a powerful framework for mapping the spatial and temporal evolution of enhancer activity across tissues and developmental stages. This method is broadly applicable to any organism compatible with enhancer-reporter assays and scRNA-seq, offering new insights into gene regulation in complex multicellular systems.