Nouveaux marqueurs pronostiques de la réponse et de la rechute aux thérapies dans les leucémies aiguës myéloblastiques

New prognostic markers of response and relapse to therapy in acute myeloblastic leukemia

• Auteur / Autrice : Claire Rouy
• Direction : Vanessa Desplat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du cancer
• Date : Soutenance le 07/11/2025
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut d'oncologie de Bordeaux (2022-....)
• Jury : Président / Présidente : Maria Mamani Matsuda
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-François Peyron
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christian Récher, Sylvain Lefort
• DOI : 10.70675/2e0daa13z2c66z4fcfzab2azc26fce6afa4c

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules souches hématopoïétiques

Thérapie moléculaire ciblée

Épissage (génétique)

Leucémie myéloïde

Mots clés libres

LAM

RTK

Anomalie de l’épissage

Signalisation oncogénique

Thérapie ciblée

AML

Tyrosine kinase

Splicing anomalies

Oncogenic signaling

Targeted therapy

Résumé

Les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) se caractérisent par un blocage en différenciation et une prolifération accrue de cellules myéloïdes immatures, appelées myéloblastes, dans la moelle osseuse et dans le sang. Les patients de moins de 60 ans atteints de LAM présentent une réponse à la chimiothérapie d’induction globalement bonne (80%) mais l’incidence importante des rechutes amène à une survie à 5 ans d’environ 50% et de 10% seulement pour les patients âgés de plus de 65 ans. Les myéloblastes sont porteurs de différentes altérations moléculaires, telles que des mutations du gène FLT3. Trente pour cent des LAM présentent une insertion en tandem (FLT3-ITD) dans le domaine juxta-membranaire ou une mutation ponctuelle dans le domaine tyrosine kinase (TKD) conduisant à une activation constitutive du récepteur FLT3. La mutation FLT3-ITD étant responsable d’un pronostic défavorable, est devenue une cible thérapeutique majeure. Ainsi, plusieurs inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) anti-FLT3 ont été développés et sont actuellement utilisés en clinique mais des résistances apparaissent. En parallèle, des anomalies de l’épissage ont également été décrites dans la LAM, participant à son hétérogénéité. Trente pour cent des gènes exprimés dans les cellules leucémiques ont un épissage anormal dont le gène FLT3. Notre groupe a découvert un nouveau variant d'épissage dans le domaine intracytoplasmique du FLT3 dans un contexte de résistance aux LAM, qui a été mis en évidence dans une cohorte bordelaise de patients au diagnostic. Les objectifs de ce projet de thèse sont de caractériser ce nouveau variant en déterminant son potentiel oncogénique dans des cellules de LAM in vitro et in vivo et d’évaluer son implication dans la résistance aux traitements. L’objectif final de ce travail est de démontrer que ce nouveau variant pourrait devenir une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait d’améliorer le traitement des patients atteints de LAM. Dans un premier temps, à l’aide d’une lignée murine dépendante à l’IL3 et transduite avec les différentes isoformes du FLT3, le potentiel oncogénique a pu être démontré par l’acquisition de l’indépendance des cellules à la cytokine. L’analyse des voies de signalisation en aval du FLT3 montre un maintien de leur activation dans les cellules exprimant le nouveau variant, comparable à celles observées lorsque le récepteur FLT3-ITD est exprimé. Ainsi, ce nouveau variant d’épissage est constitutivement actif et est capable d’engendrer une signalisation oncogénique similaire au FLT3-ITD. Pour confirmer ces résultats in vitro, les lignées murines ont été injectées dans des souris BALB/c afin de déterminer la capacité de ce nouveau variant à induire la maladie. Une prise de greffe à la fois dans la moelle osseuse et dans la rate ainsi qu’une diminution du taux de survie des souris injectées avec le nouveau variant par rapport au groupe contrôle ont pu être observées. Ces résultats valident ceux obtenus in vitro. Dans un second temps, des ITK anti-FLT3 utilisés en clinique tels que la Midostaurine®, le Gilteritinib® et le Quizartinib® ont été testés sur le nouveau variant. Ces composés n’ont pas d’effet sur la prolifération, l’apoptose ou les voies de signalisation oncogéniques des cellules. Ces résultats montrent que ce nouveau variant est résistant aux ITK et que ces composés ne sont pas de bons candidats pour inhiber son potentiel oncogénique. Enfin, la modification génétique par CRISPR-Cas9 de lignées humaines de LAM afin qu’elles expriment le nouveau variant a permis de consolider les résultats précédemment obtenus et de les approfondir en faisant une analyse de séquençage d’ARN. Les résultats de cette étude et de celle faite sur des cellules leucémiques de patients exprimant plus ou moins fortement le variant d’épissage permettra de répondre à l’objectif final de ce travail : développer de nouvelles stratégies thérapeutiques plus efficaces pour les patients atteints de LAM présentant ce variant du FLT3.

Acute myeloid leukemias (AML) are characterized by a blockade in differentiation and an increased proliferation of immature myeloid cells, known as myeloblasts, in the bone marrow and blood. AML patients under 60 years old show an overall good response to induction chemotherapy (80%), but the high incidence of relapse means that 5-year survival is around 50%, and only 10% for patients over 65 years old. The myeloblasts harbor various molecular alterations, such as mutations in the FLT3 gene. Thirty percent of AML have a tandem duplication (FLT3-ITD) in the juxta-membrane domain or a point mutation in the tyrosine kinase domain (TKD), leading to constitutive activation of the FLT3 receptor. The FLT3-ITD mutation, which is responsible for a poor prognosis, has become a major therapeutic target. Thus, several anti-FLT3 tyrosine kinase inhibitors (TKI) have been developed and are currently used in clinic, but resistance and relapse are frequent. In addition, splicing abnormalities have also been described in AML, contributing to the heterogeneity of the disease. Thirty percent of the genes expressed in leukemic cells have abnormal splicing, including the FLT3 gene. Our group has discovered a new splicing variant in the intracytoplasmic domain of FLT3 in the context of an AML resistance, who was also identified in a Bordeaux cohort of patients at diagnosis. The objectives of this thesis project are to characterize this new variant by determining its oncogenic potential in AML cells in vitro and in vivo and to evaluate its implication in treatments resistance. The final aim of this work is to demonstrate that this new variant could become a new therapeutic target which enabled to improve treatment of patient with AML. Firstly, thanks to IL3-dependent murine cell lines transduced with different isoforms of FLT3, the oncogenic potential was demonstrated through the acquisition of cell independence to this cytokine. The analysis of the downstream pathways of FLT3 show continued activation in cells expressing this new variant, similar to what is observed when cells express FLT3-ITD receptor. Thus, this new splicing variant is constitutively active and is able to induce oncogenic signaling similar to the mutation FLT3-ITD. To confirm these in vitro results, the murine cell lines were injected into BALB/c mice in order to determine the new variant capacity to induce the disease. An engraftment in the bone marrow and the spleen, together with a decrease survival of the mice injected with the new variant compare to the control group were observed. These results are in line with those obtain in vitro. Secondly, anti-FLT3 TKI used in clinics such as Midostaurin®, Gilteritinib® and Quizartinib® were tested on the new variant. These compounds don’t have any effect on cell proliferation, apoptosis and oncogenic FLT3 signaling. These results demonstrate that the new variant is resistant to TKI and these compounds are not good candidates to inhibit its oncogenic potential. Finally, using CRISPR-Cas9 mediated modification on human AML cell lines, the new variant was expressed and allowed to strengthen our previous results. To go further, by performing an RNA sequencing analysis on those modified cell lines and on patient leukemic cells expressing at different level the new splicing variant, it will allow us to answer the final aim of this work: to develop new therapeutic strategies more efficient on patients with AML expressing this new FLT3 variant.