Pince optique et microscopie de fluorescence FRET pour l'étude mécanique de cellules vivantes

Optical tweezers and FRET fluorescence microscopy for mechanical studies of living cells

• Auteur / Autrice : Camille Dubois
• Direction : Nathalie Westbrook
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 04/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ondes et Matière
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Biophotonique
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Institut d'Optique
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Physique (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Charles Fabry / Biophotonique
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Lévêque-Fort
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Tramier, Rodolphe Jaffiol, Marcelina Cardoso dos Santos
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marc Tramier, Rodolphe Jaffiol

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mécanobiologie

Cellules -- Adhésivité

Transduction du signal cellulaire

Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

Microscopie de fluorescence

Pinces optiques

Mots clés libres

Pince optique

Microscopie de fluorescence

Fret

Mécanotransduction

Adhésion focale

Biophysique cellulaire

Optical tweezer

Fluorescence microscopy

Fret

Mechanotransduction

Focal adhesion

Cell biophysics

Résumé

La mécanotransduction, processus par lequel une cellule perçoit et réagit aux stimuli mécaniques, joue un rôle central dans de nombreuses fonctions biologiques. Les adhésions focales, points d'ancrage entre le cytosquelette de la cellule et la matrice extracellulaire, sont sensibles aux propriétés mécaniques du substrat et régulent de nombreuses fonctions essentielles de la cellule comme la migration cellulaire. Un dysfonctionnement de ces mécanismes de stabilisation des adhésions focales est impliqué dans l'apparition et la progression de certaines maladies, comme le cancer.Cette thèse présente la mise en œuvre conjointe de deux méthodes de microscopie pour l'étude mécanique des adhésions focales. D'une part, les senseurs de force moléculaires basés sur la microscopie de fluorescence FRET permettent de mesurer des forces intra-cellulaires de l'ordre du picoNewton. En particulier, un senseur de force inséré sur la vinculine permet de mesurer quantitativement la tension exercée sur cette protéine impliquée dans la stabilisation des adhésions focales. D'autre part, une pince optique permet d'appliquer une force contrôlée au niveau d'une adhésion focale, et de mesurer la force exercée en retour par la cellule.Un montage d'imagerie de fluorescence FRET à 2 caméras, suffisamment simple pour être combiné avec une pince optique, a d'abord été validé par des mesures de FRET ratiométriques sur les adhésions de cellules épithéliales, qui ont été comparées à des mesures ratiométriques et par durée de vie faites dans deux laboratoires partenaires à Paris-Saclay et à l'Université de Rutgers (USA). Puis en appliquant une pince optique fixe sur des fibroblastes marqués avec VinTS et activés, une accumulation de vinculine dans la direction de la force exercée a été observée sur une échelle de temps de migration de la cellule de quelques minutes, avec dans certains cas des points d'adhésion se déplaçant le long des filaments d'actine, en sens opposé au mouvement de la cellule.

Mechanotransduction, the process by which a cell perceives and responds to mechanical stimuli, plays a central role in many biological functions. Focal adhesions, anchor points between the cell's cytoskeleton and the extracellular matrix, are sensitive to the mechanical properties of the substrate and regulate numerous essential cell functions such as cell migration. Dysfunction of these mechanisms for stabilising focal adhesions is implicated in the onset and progression of certain diseases, such as cancer.This thesis presents the joint implementation of two microscopy methods for the mechanical study of focal adhesions. On the one hand, molecular force sensors based on fluorescence FRET microscopy can be used to measure intra-cellular forces in the picoNewton range. In particular, a force sensor inserted into vinculin can be used to quantitatively measure the tension exerted on this protein, which is involved in stabilising focal adhesions. An optical tweezer is used to apply a controlled force to a focal adhesion and to measure the force exerted in return by the cell.A 2-camera FRET fluorescence imaging setup, simple enough to be combined with an optical tweezer, was first validated by ratiometric FRET measurements on epithelial cell adhesions, which were compared with ratiometric and lifetime measurements made in two partner laboratories at Paris-Saclay and Rutgers University (USA). Then, by applying a fixed optical tweezer to fibroblasts labelled with VinTS and activated, an accumulation of vinculin in the direction of the force exerted was observed over a cell migration time scale of a few minutes, with in some cases adhesion points moving along the actin filaments, in the opposite direction to the movement of the cell.