Développement De Tissus Musculaires En 3D Pour Le Criblage De Thérapie Génique Et Évaluation Thérapeutique De Nouvelles Midi-Dystrophines Dans La Dystrophie Musculaire De Duchenne

Development of 3D muscle tissues for gene therapy screening and therapeutic evaluation of novel Midi-Dystrophins in Duchenne Muscular Dystrophy context

• Auteur / Autrice : Laura Palmieri
• Direction : Sonia ALBINI
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 18/09/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Approches génétiques intégrées et nouvelles thérapies pour les maladies rares (Evry, Essonne)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Slimane Ait-Si-Ali
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Relaix, Sestina Falcone, Andrea Burgo, Frédérique Magdinier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Frédéric Relaix, Sestina Falcone
• DOI : 10.70675/744dc52bzc123z4fb0zb0b1za54b90aa63f5

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thérapie génique

Dystrophine

Techniques de cultures cellulaires tridimensionnelles

Mots clés libres

Dystrophie Musculaire de Duchenne

Thérapie Génique

3D culture

Adeno-Associated virus

Dystrophine

Inteines

Duchenne Muscular Dystrophy

Gene Therapy

3D cultures

Adeno-Associated virus

Dystrophin

Inteins

Résumé

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), encore incurable, est due à l'absence de dystrophine, une protéine essentielle pour préserver l'intégrité musculaire continuellement mise à l'épreuve par les contractions. La thérapie génique utilisant le virus adéno-associé (AAV) pour délivrer des formes tronquées de dystrophine (µDys) est actuellement l'approche thérapeutique la plus prometteuse. Cependant, les résultats obtenus chez les patients diffèrent de ceux des études animales, ce qui souligne la nécessité de disposer de modèles permettant de prédire avec précision la réponse humaine. En outre, la µDys est dépourvue de domaines fonctionnels et présente un sauvetage incomplet, ce qui suggère que l'expression de dystrophines plus grandes avec des domaines supplémentaires est nécessaire pour une correction phénotypique complète. Au cours de mon doctorat, j'ai généré les MYOrganoids, une plateforme musculaire en 3D dérivée de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC), dont la maturation est améliorée par l'incorporation de fibroblastes. J'ai ensuite employé des fibroblastes DMD pour exacerber les caractéristiques pathogènes des MYOrganoids DMD, telles que la fibrose et la perte de force musculaire. J'ai montré que le transfert de gène μDys dans les MYOrganoids DMD améliorait la résistance musculaire ; cependant, seule une correction partielle de la signature DMD a été observée, soulignant le potentiel de notre approche de bio-ingénierie pour le criblage de la thérapie génique. En outre, j'ai généré trois nouvelles midi-dystrophines (midi-Dys) avec des domaines fonctionnels supplémentaires. En validant leur efficacité in vitro et in vivo, j'ai constaté que midi-Dys était 50 % moins exprimé que µDys à des doses équivalentes, tout en conservant des effets thérapeutiques similaires sur la fibrose et le sauvetage fonctionnel. Notamment, dans le diaphragme, midi-Dys a surpassé µDys dans la réduction des zones fibrotiques, suggérant la supériorité de midi-Dys comme option thérapeutique pour la dystrophie musculaire de Duchenne. Dans l'ensemble, ce travail aborde les limitations importantes du remplacement de gènes par AAV et présente une nouvelle méthode pour exprimer efficacement des protéines extra-larges et hautement fonctionnelles.

The yet incurable Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by the absence of dystrophin, a protein essential to preserve muscle integrity continuously challenged by contractions. Gene therapy exploiting adeno-associated virus (AAV) to deliver truncated forms of dystrophin (µDys) is currently the most promising therapeutic approach. However, patient outcomes differed from animal studies, emphasizing the necessity for models to predict accurately human response. Additionally, µDys is missing functional domains and it shows incomplete rescue, suggesting that the expression of larger dystrophins with additional domains is required for a complete phenotypical correction. During my PhD, I generated the MYOrganoid, a 3D muscle platform derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC), whose maturation is enhanced by fibroblast incorporation. I then employed DMD fibroblasts to exacerbate pathogenic hallmarks of DMD MYOrganoids, such as fibrosis and muscle force loss. I showed that μDys gene transfer in DMD MYOrganoids improved muscle resistance; however, only partial correction of the DMD signature was observed, underlining the potential of our bioengineering approach for gene therapy screening. Furthermore, I generated three novel midi-dystrophins (midi-Dys) with additional functional domains. Validating their efficacy in vitro and in vivo, I found midi-Dys to be 50% less expressed than µDys at equivalent doses yet maintaining similar therapeutic effects on fibrosis and functional rescue. Notably, in the diaphragm, midi-Dys outperformed µDys in reducing fibrotic areas, suggesting the superiority of midi-Dys as a therapeutic option for Duchenne muscular dystrophy. Overall, this work addresses important limitations of AAV-based gene replacement and presents a novel method to efficiently express large and highly functional extra-large proteins.