Contrôle post-transcriptionnel de l'ARNm timeless dans l'horloge circadienne de la Drosophile

Post-transcriptional control of the timeless mRNA in the Drosophila circadian clock

• Auteur / Autrice : Thierry Cottineau
• Direction : Brigitte Grima
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 02/07/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des neurosciences Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Laurent Théodore
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Besse, Ouria Dkhissi-Benyahya, Clément Chapat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Florence Besse, Ouria Dkhissi-Benyahya

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN -- Modifications posttranscriptionnelles

ARN messagers

Traduction génétique

Rythmes circadiens

Mots clés libres

Rythmes circadiens

Gènes d'horloge

CCR4-Not

Traduction

ARNm

Queue poly(A)

Circadian rhythms

Clock genes

CCR4-Not

Translation

.mRNA

Poly(A) tail

Résumé

La vie sur Terre est régie par des cycles jour/nuit causés par la rotation de celle-ci autour de son axe. Des horloges circadiennes ont évolué dans la majorité des organismes vivants, permettant l'anticipation de ces cycles, apportant ainsi un avantage conséquent au travers de l'organisation temporelle de leurs processus biologiques. Les rythmes circadiens (du latin circa : environ, et diem : jour) sont contrôlés génétiquement par des horloges endogènes, que l'on retrouve à l'échelle cellulaire. Des boucles de rétrocontrôles ciblant la transcription, traduction ou régulations post-traductionnelles de produits de gènes d'horloges, qui sont alternativement activées ou réprimées en respectant des intervalles précis, génèrent des oscillations à une période proche de 24 heures. Drosophila melanogaster est un organisme modèle essentiel dans la compréhension du fonctionnement de l'horloge circadienne. En effet, la disponibilité de nombreux outils génétiques ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régissant l'horloge. Il a ainsi été découvert que les protéines PERIOD (PER) et TIMELESS (TIM) exercent un rétrocontrôle sur leur propre expression en réprimant l'activité des deux facteurs de transcription CLOCK (CLK) et CYCLE (CYC), qui contrôlent leur niveau d'expression ainsi que celui d'autres gènes régulés par l'horloge. Les contrôles transcriptionnels et post-traductionnels impliqués dans l'horloge ont été largement étudiés ces dernières 40 années. En revanche, les contrôles post-transcriptionnels et traductionnels sont moins bien compris, bien que ces régulations soient des éléments importants afin de générer des oscillations. Des travaux précédemment publiés par l'équipe ont mis en évidence l'existence d'un contrôle post-transcriptionnel de l'ARNm timeless par sa déadénylation par la déadénylase du complexe CCR4-NOT, POP2, où, la déplétion de cette déadénylase altère le comportement circadien des mouches en modifiant les niveaux d'ARNm tim et de protéines TIM. Cette régulation intervient de manière circadienne, dépendante de PER, et spécifique pour tim, puisque l'ARNm per n'est pas impacté par POP2. L'objectif de mon travail était de mieux comprendre le contrôle de POP2 sur tim. En utilisant à la fois des techniques d'analyses comportementales et de biologie moléculaires, comme le TRAP (Purification Affine de Ribosomes en cours de Traduction), et le RNA-seq, nous avons découvert de nouvelles formes de contrôle de l'horloge circadienne. Tout d'abord, nos résultats montrent un contrôle traductionnel oscillant des ARNms per et tim, en phase avec l'oscillation de leur niveau protéique, suggérant une contribution nouvelle à l'oscillation des protéines d'horloges. Ensuite, nos résultats indiquent que POP2 contrôle la déadénylation de tim principalement en fonction de l'abondance de ce dernier, avec un effet réduit lorsque les niveaux d'ARNm tim sont élevés, comme c'est le cas en absence de PER. Cela s'applique également à l'échelle du transcriptome, où les transcrits régulés par POP2 le sont en fonction de leur abondance aussi. Puisque le complexe CCR4-NOT est connu pour réguler à la fois la stabilité des ARNms et leur traduction, nous avons cherché un rôle potentiel de POP2 sur la traduction dans l'horloge. Nous avons trouvé que POP2 régule la traduction de l'ARNm tim ainsi que celle de vrille, un répresseur transcriptionnel qui contrôle la transcription du gène Clock. Nos analyses transcriptomiques suggèrent que la déadénylase POP2 contribue fortement au contrôle de l'oscillation de nombreux gènes régulés de manière circadienne.

Life is submitted to day-night cycles caused by the rotation of the Earth around its axis. Circadian clocks evolved in most living organisms to allow for the anticipation of these cycles, hence providing a considerable advantage through the temporal organization of their biological processes. The circadian (from the latin circa: about, and diem: day) rhythms are genetically controlled by endogenous clocks, that can be found down to the cellular level. Feedback loops that include transcription, translation, or post-translational regulations of clock gene products that are alternatively activated/repressed with precise delays, generate oscillations with a period close to 24 hours. Drosophila melanogaster is an essential model organism in the understanding of the functioning of the circadian clock. Indeed, the many genetic tools available allowed to better understand the molecular mechanisms governing the clock. This led to the discovery that the protein PERIOD (PER) and TIMELESS (TIM) feedback on their own expressions through the repression of the activity of the two transcription factors CLOCK (CLK) and CYCLE (CYC), that control their levels of expression as well as other clock regulated genes. The transcriptional and post-translational controls involved in the clock have been extensively studied in the past 40 years. However, less is known of the post-transcriptional and translational controls of the clock, although these regulations are of importance for generating the oscillations. Previous work from the laboratory reported evidence of a post-transcriptional control of tim mRNA through its deadenylation by the deadenylase POP2 of the CCR4-NOT complex, where depletion of this deadenylase altered the circadian behavior of the flies as well as the cycling of tim mRNA and TIM protein levels. This regulation was found to be circadian, PER-dependent, and specific for tim, as per mRNA is not impacted by POP2. The aim of my work was to further understand the control of POP2 on tim. Using combined behavioral assays and molecular biology techniques, such as TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) and RNA-seq, we discovered new layers of control of the circadian clock. First of all, our results show that the translational control of tim and per is circadianly-regulated and in phase with the cycling of protein levels, suggesting a new contribution to clock protein oscillations. Then, we revealed that POP2-controlled tim mRNA deadenylation largely depends on tim mRNA abundance, with small effects when tim mRNA levels are high as it is the case in the absence of PER. This also applies at the transcriptome scale, where we see that POP2-regulated transcripts are impacted in function of their abundance. Since the CCR4-NOT complex is known to regulate both mRNA stability and translation, we investigated the role of POP2 on translation in the clock. We found that POP2 regulates tim mRNA translation as well as the translation of vrille, a transcriptional repressor that controls the transcription of the Clock gene. Transcriptome-wide analysis suggest that the POP2 deadenylase has strong contribution to the control of the oscillations of many circadianly-regulated transcripts.