Rôle de la polyadénylation intronique dans la réponse des cellules cancéreuses au cisplatine

Role of intronic polyadenylation in cancer cell response to cisplatin

• Auteur / Autrice : Alexandre Devaux
• Direction : Martin Dutertre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences du Cancer
• Date : Soutenance le 25/03/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome, ARN et cancer (2010-....) - Integrite du genome, ARN et cancer
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté de médecine
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Serge Plaza
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stefania Millevoi, Cyril Bourgeois, Valeria Naim
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stefania Millevoi, Cyril Bourgeois

Mots clés

Mots clés contrôlés

Polyadénylation

Anticancéreux

Poumon -- Cancer

Chimiothérapie

Mots clés libres

Cancer du poumon

Cisplatine

Épissage alternatif

Microprotéines

Polyadénylation intronique

U1- AMO

Lung cancer

Cisplatin

Alternative splicing

Microproteins

Intronic polyadenylation

U1-AMO

Résumé

Au cours d’études sur la polyadénylation alternative (APA), des transcrits courts terminant dans un exon final alternatif ont été découverts, on parle de polyadénylation intronique (IPA). L’IPA est régulée par des facteurs de l’épissage (dont U1 snRNP), de polyadénylation, et d’élongation de la transcription (dont CDK12). Les isoformes IPA sont régulées par des agents génotoxiques (induisant des dommages à l’ADN), dont les rayonnements UV et la doxorubicine. Les inhibiteurs de CDK12 augmentent l’IPA dans des gènes de réparation de l’ADN et la sensibilité cellulaire à des génotoxiques. L’IPA a souvent lieu dans la région codante des gènes, générant des protéines altérées en carboxy terminal. Cependant, des transcrits IPA sont aussi générés dans les premiers introns des gènes, on parle alors de 5’IPA. Des transcrits 5’IPA sont dégradés par l’exosome nucléaire, mais certains sont abondants et ont un faible potentiel codant. Deux d’entre eux, issues des gènes ASCC3 et CDKN1A, ont des fonctions non codantes. Par ailleurs, des études montrent par Ribo-seq et spectrométrie de masse (MS) l’existence, dans des ARNm et des lncRNA, de petits cadres de lecture ouverts (sORF) codant des microprotéines (miP, protéines de moins de 100 aa) qui peuvent être fonctionnelles. Aucune miP n’a été rapportée dans des isoformes 5’IPA. Le cisplatine (CisPt) est un agent pontant de l'ADN très utilisé dans les cancers du poumon non à petites cellules (NSCLC). Mon équipe a observé par 3’-seq dans des cellules NSCLC que le CisPt augmente l’expression des isoformes IPA par rapport aux ARNm canoniques (ratio IPA:LE) dans de nombreux gènes, et que certaines isoformes IPA sont peu engagées dans les polysomes lourds et sont issues de la région en amont du site d’initiation de la traduction annoté du gène (isoformes 5’UTR-IPA). Mes objectifs étaient de déterminer le rôle de l’IPA dans la réponse cellulaire au CisPt. Je me suis intéressé premièrement au rôle des isoformes 5’UTR-IPA. Pour deux d’entre elles, issues des gènes PRKAR1B et PHF20, j’ai montré que leur déplétion par siARN augmente la survie de cellules NSCLC au CisPt. Ces deux isoformes sont engagées dans des fractions polysomiques légères. Des analyses de bases de données de Ribo-seq et de MS ont révélé l’existence de sORF dans ces deux isoformes. Par transfection de vecteurs contenant ces isoformes 5’UTR-IPA et en balisant leurs sORF, j’ai observé en ImmunoFluorescence (IF) et Western Blot que l’isoforme 5’UTR-IPA de PRKAR1B code une miP. La délétion de cette isoforme IPA endogène ou la mutation de l’ATG de sa sORF par CRISPR ont donné un phénotype similaire au siARN. Il s’agit de la première isoforme 5’UTR-IPA codant une miP (miP-5’UTR-IPA). Par croisement de nos données de 3’-seq avec des données de Ribo-seq et de MS, nous avons identifié une centaine d’isoformes miP-5’UTR-IPA potentielles induites par le CisPt. Deuxièmement, je me suis intéressé à la possibilité de sensibiliser des cellules NSCLC au CisPt en ciblant U1 snRNP par un oligonucléotide (U1-AMO) qui induit l’IPA dans de nombreux gènes. Dans plusieurs lignées cellulaires NSCLC, j’ai pu montrer une sensibilisation par U1-AMO au CisPt en termes d’inhibition de croissance cellulaire et d’induction de dommages à l’ADN (foyers ƴH2AX). Cette sensibilisation est liée à une réduction (en 3’-seq et RT-qPCR) de l'expression des ARNm canoniques dans des gènes de réparation des pontages de l'ADN (voies de Fanconi et de l’excision de nucléotides). Cependant, U1-AMO prévient les blocages de cycle cellulaire induits par le CisPt, ainsi que les effets du CisPt sur le ratio IPA:LE de nombreux gènes. Mes travaux montrent l’impact de l’IPA sur la réponse des cellules cancéreuses au CisPt, et révèlent un nouveau paradigme génétique, appelé miP-5’UTR-IPA, dans lequel des gènes produisent par IPA des transcrits courts codant des miP.

During studies on alternative polyadenylation (APA), short transcripts ending in an alternative last exon were discovered, known as intronic polyadenylation (IPA). IPA is regulated by splicing factors (including U1 snRNP), polyadenylation factors and transcription elongation factors (including CDK12). IPA isoforms are regulated by genotoxic agents (inducing DNA damage), including UV radiation and doxorubicin. Conversely, CDK12 inhibitors increase both IPA in DNA repair genes and cellular sensitivity to genotoxic agents. IPA often occurs in the coding region of genes, generating carboxy-terminally altered proteins. However, IPA transcripts are also generated in the first introns of genes, known as 5'IPA. Many 5'IPA transcripts are degraded by the nuclear exosome, but some are abundant and have a low coding potential. Two of these, derived from the ASCC3 and CDKN1A genes, have non-coding functions. In addition, studies using Ribo-seq and mass spectrometry (MS) are showing the existence -in mRNAs and lncRNAs- of small open reading frames (sORF) encoding microproteins (miP, proteins of less than 100 aa) which can be functional. No miP has been reported in 5'IPA isoforms. Cisplatin (CisPt) is a DNA-crosslinking agent widely used in non-small cell lung cancer (NSCLC). My team observed, by 3'-seq in NSCLC cells, that CisPt increases the expression of IPA isoforms compared to canonical mRNAs (IPA:LE ratio) in many genes, and that some IPA isoforms are poorly associated with heavy polysomes and are derived from the region upstream of the annotated translation initiation site of the gene (5'UTR-IPA isoforms). My objectives were to determine the role of IPA in cell response to CisPt. I first looked at the role of 5'UTR-IPA isoforms. For two of them, derived from the PRKAR1B and PHF20 genes, I showed that their depletion by siRNA increased the survival of NSCLC cells to CisPt. These two isoforms are associated with light polysomal fractions. Analyses of Ribo-seq and MS databases revealed the existence of sORFs in these two isoforms. By transfecting vectors containing these 5'UTR-IPA isoforms and by tagging their sORFs, I observed by ImmunoFluorescence (IF) and Western Blot that the 5'UTR-IPA isoform of PRKAR1B encodes a miP. Deletion of this IPA isoform or mutation of the sORF ATG endogenously by CRISPR gave a phenotype similar to the siRNAs. This is the first 5'UTR-IPA isoform encoding a miP (miP-5'UTR-IPA). By cross-referencing our 3'-seq data with Ribo-seq and MS data, we identified around a hundred potential miP-5'UTR-IPA isoforms induced by CisPt. Secondly, I investigated the possibility of sensitizing NSCLC cells to CisPt by targeting U1 snRNP with an antisense oligonucleotide (U1-AMO), that induces IPA in many genes. In several NSCLC cell lines, I showed sensitization to CisPt by U1-AMO in terms of cell growth inhibition and DNA damage induction (ƴH2AX foci). This sensitization is linked to a reduced expression of the canonical mRNAs of DNA crosslinks repair pathways (Fanconi and nucleotide excision repair), as shown by 3'-seq and RT-qPCR. However, U1-AMO prevented CisPt- induced cell cycle block and the effects of CisPt on the IPA:LE ratio of many genes. My work shows the impact of IPA on the response of cancer cells to CisPt, and reveals a new genetic paradigm, called miP-5'UTR-IPA, in which genes produce short miP-encoding transcripts by IPA.