Régulation de la formation des nucléofilaments Rad51 par les complexes de paralogues de Rad51 chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Regulation of Rad51 nucleofilament formation by Rad51 paralog complexes in Saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : Chloé Dupont
• Direction : Eric Coïc, Laurent Maloisel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 16/02/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Stabilité génétique, cellules souches et radiations (Fontenay-aux-Roses, Hauts-de-Seine ; 2019-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté des sciences d’Orsay (Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Fabienne Malagnac
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Baudat, Aurèle Piazza, Valérie Borde, Josée Guirouilh-Barbat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Frédéric Baudat, Aurèle Piazza

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rad51 Recombinase

ADN -- Réparation

Recombinaison homologue

Mots clés libres

Recombinaison homologue

Filaments Rad51

Paralogues de Rad51

Réparation de l'ADN

Rad52

Srs2

Homologous recombination

Rad51 filament

Rad51 paralogs

DNA repair

Rad52

Srs2

Résumé

La recombinaison homologue (RH) est une des voies majeures de réparation des dommages de l'ADN telles que les cassures double brin (CDB). Cette voie est également impliquée dans le redémarrage des fourches de réplication bloquées à une lésion. Une étape clé de cette voie de réparation consiste en la formation de filaments nucléoprotéiques formés de la recombinase Rad51 sur de l'ADN simple brin (ADNsb). Ces nucléofilaments sont responsables de la recherche d'homologie et de l'invasion d'un ADN intact et semblable à l'ADN endommagé afin de l'utiliser comme matrice pour la synthèse réparatrice. La formation de ces nucléofilaments est finement régulée. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la formation des filaments Rad51 est assurée par les régulateurs positifs que sont la protéine médiatrice Rad52 et les deux complexes composés de protéines paralogues de Rad51, le complexe Rad55-Rad57 et le complexe SHU. Ils jouent également un rôle de protection de ce nucléofilament face au régulateur négatif Srs2 dont ils contrebalancent les effets de désassemblage. Pour mieux comprendre le mécanisme de régulation du nucléofilament Rad51, une connaissance plus approfondie des interactions complexes intervenant entre ces multiples acteurs est nécessaire. Durant ma thèse, nous avons cherché à déterminer la structure des complexes de paralogues de Rad51 en association avec les filaments de Rad51. Pour cela, nous avons combiné une approche bio-informatique structurale, basée sur des alignements de séquences et la structure publiée de Rad51, avec des expériences de double-hybride de levure (Y2H). Cette stratégie nous a permis de proposer pour la première fois un modèle pour l'organisation des complexes de paralogues de Rad51, les complexes Rad55-Rad57 et SHU, en association avec la recombinase Rad51. Ce modèle a été validé par des analyses génétiques de mutations perturbant chaque domaine d'interaction. Dans notre modèle, Rad55-Rad57 adopte une structure similaire à celle d'un dimère de Rad51 et n'interagit qu'avec l'extrémité 5' des filaments de Rad51 et uniquement par l'intermédiaire de la sous-unité Rad57. Nos analyses génétiques suggèrent que le rôle principal de l'interaction entre Rad55-Rad57 et Rad51 est de protéger les filaments Rad51 contre la translocase Srs2. De l'autre côté de Rad55-Rad57, Rad55 interagit avec la sous-unité Csm2 du complexe SHU par son extrémité N-terminale. Il est intéressant de noter que nos analyses génétiques ont révélé que SHU et l'extrémité N-terminale de Rad55 sont dispensables pour la réparation des CDB. Ils sont en revanche impliqués dans la réparation des brèches simple brin induites par les UV. Nous proposons que le complexe SHU stabilise la liaison de Rad55-Rad57 sur les brèches simple brin, favorisant ainsi une meilleure stabilité des filaments de Rad51. Ainsi, les filaments Rad51 seraient plus résistants à l'activité déstabilisatrice de l'hélicase anti-recombinase Srs2 et permettraient à la RH de rivaliser avec d'autres voies de tolérance aux dommages de l'ADN impliquant des ADN polymérases translésionnelles responsables de l'incorporation de mutations. Nos données permettent de proposer un modèle d'installation du filament Rad51 par les complexes de paralogues, Rad55-Rad57 et SHU, en collaboration avec Rad52.

Homologous recombination (HR) is one of the major repair pathways for DNA damage such as double-strand breaks (DSBs). This pathway is also involved in restarting replication forks stalled by DNA lesion. A key step in this repair pathway involves the formation of nucleoprotein filaments formed by Rad51 recombinase on single-stranded DNA (ssDNA). These nucleofilaments are responsible for homology search and invasion of an intact DNA similar to the damaged DNA in order to use it as a template for repair synthesis. The formation of these nucleofilaments is tightly regulated. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, the formation of Rad51 filaments is ensured by positive regulators such as the Rad52 mediator protein and the two complexes composed of Rad51 paralogue proteins, the Rad55-Rad57 complex and the SHU complex. They also play a role in protecting this nucleofilament from the negative regulator Srs2 by counterbalancing its disassembly effects. To gain a better understanding of the regulatory mechanism of the Rad51 nucleofilament, we need a more detailed understanding of the complex interactions between these multiple players. During my thesis, we aimed at determining the structure of Rad51 paralog complexes in association with Rad51 filaments. To do this, we combined a structural bioinformatics approach, based on sequence alignments and the published structure of Rad51, with yeast two-hybrid (Y2H) experiments. This strategy allowed us to build for the first time a model for the organisation of Rad51 paralog complexes, the Rad55-Rad57 and SHU complexes, in association with the Rad51 recombinase. This model was further validated by genetic analysis of mutations disrupting each interaction domain. In our model, Rad55-Rad57 adopts a similar structure than a dimer of Rad51 and it interacts only with the 5'-end of Rad51 filaments and only through the Rad57 subunit. Our genetic analyses suggest that the major role of the interaction between Rad55-Rad57 and Rad51 is to protect Rad51 filaments against the Srs2 translocase. On the other side of Rad55-Rad57, Rad55 interacts with the Csm2 subunit of the SHU complex through its N-terminal end. Interestingly, our genetic analyses revealed that SHU and the N-terminal end of Rad55 are dispensable for DSB repair. However, they are involved in the repair of UV-induced single-strand breaks. We propose that the SHU complex stabilizes the binding of Rad55-Rad57 on ssDNA gaps, thereby promoting enhanced stability of Rad51 filaments. Thus, Rad51 filaments would be more resistant to the destabilising activity of the Srs2 translocase and would allow HR to compete with alternative gap filling pathways involving error-prone translesion DNA polymerases. Our data allow us to propose a model for the installation of the Rad51 filament by paralog complexes, Rad55-Rad57 and SHU, in collaboration with Rad52.