Étude des interactions de ligands et d'anticorps avec les i-motifs de l'ADN

Study of the interactions of ligands and antibodies with DNA i-motifs

• Auteur / Autrice : Joseph Boissieras
• Direction : Anton Granzhan, Dennis Gomez-Zamorano
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 09/12/2024
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et modélisation pour la biologie du cancer (Orsay, Essonne ; 2015-....) - Institut de pharmacologie et de biologie structurale (Toulouse ; 1996-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté des sciences d’Orsay (Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Gilles Gasser
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Louis Mergny, Marcel Hollenstein, Rachel Méallet-Renault
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Louis Mergny, Marcel Hollenstein

Mots clés

Mots clés contrôlés

Motifs nucléotidiques

Reconnaissance moléculaire

Interactions ADN-ligand

Mots clés libres

Structures de l'ADN

Ligands de l'ADN

Reconnaissance moléculaire

I-Motifs

DNA structures

DNA ligands

Molecular recognition

I-Motifs

Résumé

Les i-motifs sont des structures tétramériques d'ADN constituées de paires de bases CH+:C intercalées et qui peuvent se former dans des séquences d'ADN riches en cytosine, notamment dans les conditions légèrement acides (pH≈6,0) où certaines cytosines seront protonées. Bien qu'elles soient connues depuis plus de 30 ans, du fait de leur forte dépendance au pH ces structures ont longuement été considérées comme uniquement présentes in vitro. Plus récemment, en 2018, un anticorps iMab a été développé pour cibler les i-motifs et les études ont suggéré leur présence au niveau cellulaire. De nombreuses séquences pouvant former des i-motifs ont été identifiées dans des zones actives du génome, au niveau de télomères ou de promoteurs d'oncogènes, suggérant alors de potentiels rôles biologiques de cette structure. Afin de déterminer ces effets, des outils complémentaires à l'anticorps doivent être développés afin de pouvoir contrôler la formation et la stabilité du i-motif. Ces composés chimiques, capables de stabiliser la structure et ainsi de contrôler sa formation, sont appelés ligands. De nombreux composés ont été décrits au fil des années mais aucun composé n'a aujourd'hui été unanimement admis comme ligand de i-motif de l'ADN. Cette absence de ligand de référence s'explique notamment par les méthodes utilisées jusqu'à présent pour observer les interactions des molécules avec la structure du i-motif. En effet, les techniques employées ont été héritées des études d'autres structures d'ADN et de nombreux biais introduits par celles-ci ont été identifiés, remettant en question les effets précédemment observés. Afin d'éclaircir le sujet et de conclure sur les différents effets de composés, nous avons alors proposé une méthode d'étude spécifique aux i-motifs permettant d'évaluer les effets de ligands sur la structure. Pour cela, une méthode dite de titration potentiométrique, basée sur des études de dichroïsme circulaire à différents pH à température constante, a été développée et validée sur le i-motif. Cette technique permet d'observer sans marquage de l'ADN l'état de ce dernier à différents pH, et ainsi de détecter une stabilisation causée par un ligand. Cette méthode a ensuite été couplée à des études thermiques et les deux ont alors été utilisées pour tester différents composés issus de la littérature et observer leurs effets sur la stabilité du i-motif vis-à-vis du pH. Nos résultats montrent que parmi tous les composés testés, aucune des petites molécules testées n'est capable de stabiliser un i-motif natif. Si trois composés (TMPyP4, BRACO-19 et Mitoxantrone) ont montré un effet déstabilisant sur la structure, seul le complexe [Ru(phen)2dppz]2+ a montré une certaine capacité de stabilisation. Néanmoins, cette stabilisation n'a été observée que sur une séquence spécifique à longues boucles, suggérant que cette interaction ne se fait que par des interactions avec des boucles d'ADN. Les effets des autres composés ont également été étudiées sur ces boucles, suggérant que les effets précédemment observés dans la littérature ne résultent que d'interactions à longues boucles, non spécifiques au i-motif. Dans la seconde partie, la spécificité de l'anticorps iMab a également été testée et les résultats démontrent que cet anticorps cible des séquences d'ADN riches en cytosines et non spécifiquement le i-motif. D'autres résultats indiquent même que cet anticorps est capable de déplier le i-motif suggérant là encore que cet anticorps se lie aux séquences C-riches dépliées. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse ne montrent qu'aucun des composés testés n'est capable de stabiliser le i-motif en interagissant directement avec le i-motif, mettant en lumière les difficultés de cibler la structure. De plus, les résultats concernant l'anticorps remettent en question l'interprétation des foyers nucléaires observés dans d'autres études et qui représentent aujourd'hui les seules observations de i-motifs natifs au niveau cellulaire.

I-Motifs are tetrameric DNA structures constituted by mutually intercalated CH+:C base pairs that can form in cytosine-rich DNA sequences under slightly acidic conditions (pH ≈ 6.0) where some of cytosines are protonated. They have been known for over thirty years, but due to their strong pH dependence, these structures were long considered to exist only in vitro. Quite recently, in 2018, studies renewed interest in the i-motif suggesting its presence at the cellular level, especially due to the development of the iMab antibody, raised against i-motifs. Numerous sequences capable of forming i-motifs have been identified in active regions of the genome, such as at telomeres or oncogene promoters, suggesting potentially important biological roles for this structure. To determine these effects, tools complementary to antibodies need to be developed to control i-motif formation and stability. These chemical compounds capable of stabilizing the structure and thus controlling its formation are called ligands. Many compounds have been described over the years, but none has yet been unanimously accepted as a ligand for DNA motifs. This absence of a reference ligand is partly explained by the methods used so far to observe small-molecule interactions with the i-motif structure. Indeed, the techniques employed were inherited from studies of other DNA structures, and many biases introduced by them have been identified, calling previous observations into question. To clarify the subject and conclude on the various effects of compounds, we proposed a specific method for studying i-motifs that allows the evaluation of ligands' effects on these structures. Toward this end, a potentiometric titration method, based on circular dichroism studies at different pH, was developed and validated for the i-motif. This technique allows the observation of DNA conformation without labelling at different pH, thereby detecting stabilization caused by a ligand by measuring the transition pH between folded and unfolded DNA, in isothermal conditions. This method was then coupled with thermal studies, and both were used to test different compounds previously described in the literature and observe their effects on the i-motif's stability in relation to pH. The results show that among all the tested compounds, none were capable of stabilizing native i-motifs. While three compounds (TMPyP4, BRACO-19, and Mitoxantrone) did indeed show a destabilizing effect on the structure, only the complex [Ru(phen)2dppz]2+ demonstrated some stabilizing capacity. However, this stabilization was only observed with a specific sequence with long loops, suggesting that this interaction occurs through interactions with DNA loops. The effects of other compounds on these loops were also studied, suggesting that the effects previously observed in the literature resulted from secondary, non-specific interactions with the i-motif loops. In the second part of this thesis, the selectivity of the iMab antibody was also assessed, and the results show that this antibody targets cytosine-rich DNA sequences rather than the i-motif specifically. Other results even indicate that this antibody can unfold the i-motif, further suggesting that it binds to unfolded C-rich sequences rather than to i-motifs. Overall, the results presented in this study show that none of the tested compounds could stabilize the i-motif by directly interacting with it, highlighting the difficulties of targeting this DNA structure. Additionally, the results concerning the iMab antibody call into question the interpretation of nuclear foci observed in other studies, which currently represent the only evidence of native i-motifs at the cellular level.