Approches d'édition du génome et de l'épigénome pour traiter les β-hémoglobinopathies

Genome and epigenome editing approaches to treat β-hemoglobinopathies

• Auteur / Autrice : Letizia Fontana
• Direction : Annarita Miccio
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 16/12/2024
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Mario Amendola
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Carine Giovannangeli, Maria De Grandis
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rasmus O. Bak, Eric Soler

Mots clés

Mots clés contrôlés

bêta-Thalassémie

Édition génomique

Méthylome

Drépanocytose

Mots clés libres

SS-hémoglobinopathies

Drépanocytose

SS-thalassémie

Éditeurs de base

Éditeurs d'épigénome

Édition de gènes

Thérapie génique

SS-hemoglobinopathies

Sickle cells diseases

SS-thalassemia

Base editors

Epigenome editors

Gene editing

Gene therapy

Résumé

Drépanocytose et bêta-thalassémie sont dues à des mutations affectant la production de la chaîne de globine β. La sévérité clinique est atténuée par des mutations augmentant la quantité d'hémoglobine fœtale (HbF), une condition appelée persistance héréditaire d'HbF à l'âge adulte. La transplantation autologue de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques (CSPH) génétiquement corrigées est prometteuse. Une approche CRISPR/Cas9 pour réprimer BCL11A, un répresseur de la globine γ, a été approuvée mais comporte des risques de génotoxicité dues aux cassures double brin (CDB). Nous avons ciblé les sites de liaison (SL) des activateurs transcriptionnels GATA1 et ATF4, présents dans les régions +58-kb et +55-kb, respectivement, des enhancers érythroïdes de BCL11A, avec des éditeurs de base (BEs) pour introduire des mutations ponctuelles précises sans créer de CDBs. Des ARN guides (ARNg) ont été testés dans des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de patients drépanocytaires en combinaison avec des BEs, générant différents nucléotides dans les motifs de liaison avec une efficacité d'édition atteignant 90 %, avec peu ou pas d'indels induits par les CDB. La réactivation d'HbF a été observée dans tous les échantillons édités, mesurée par HPLC, mais pas suffisante pour un sauvetage complet du phénotype dans les cellules érythroïdes issues des CSPHs drépanocytaires éditées. Nous avons donc ciblé simultanément les SL de GATA1 et ATF4 pour augmenter les niveaux d'HbF. Les cellules éditées au niveau des enhancers +58 et +55 ont montré une augmentation de l'expression d'HbF par rapport aux cellules recevant des ARNg individuels, dépassant les niveaux atteints avec la stratégie CRISPR/Cas9. Enfin, la réactivation de l'HbF était suffisante pour permettre un sauvetage substantiel du phénotype malade, diminuant le nombre de cellules drépanocytaires à 16,4%. Pour évaluer les effets hors cibles, nous avons utilisé le GUIDE-seq couplé au séquençage ciblé, le séquençage de l'exome entier et le RNA-seq, tandis que les effets indésirables présent dans les sites cibles ont été évalués par séquençage Long read. L'efficacité du BE pour repeupler les CSH a été démontrée en transplantant des CSH éditées dans des souris immunodéficientes, prouvant l'efficacité de l'édition simultanée des éléments transrégulateurs de la globine γ pour la réactivation de l'HbF. Cette preuve de concept permettra le développement préclinique et clinique de CSH modifiées pour le traitement des β-hémoglobinopathies. Cependant, des travaux récents montrent que les BEs peuvent également générer de larges délétions ou indels (Antoniou et al. 2022). Ainsi, une nouvelle stratégie basée sur l'édition de l'épigénome a été développée pour moduler l'expression des gènes sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente. Nous avons analysé les marques épigénétiques dans deux régions cis-régulatrices clés, les promoteurs de HBG et les enhancers de BCL11A, dans des cellules érythroïdes dérivées de CSPH. Des marques épigénétiques répressives, telles que la méthylation de l'ADN, ont été détectées au niveau des promoteurs de HBG dans des cellules érythroïdes adultes n'exprimant pas la globine γ. En revanche, la déméthylation de l'ADN et les marques épigénétiques activatrices telles que l'acétylation de la lysine 27 de l'histone 3 (H3K27ac) et la triméthylation de la lysine 4 (H3K4me3) ont été détectées au niveau des promoteurs de HBG dans les cellules érythroïdes exprimant la globine γ. La forte expression de BCL11A dans les cellules érythroïdes adultes est associée à de faibles niveaux de méthylation de l'ADN au niveau des enhancers de BCL11A. L'inactivation des enhancers de BCL11A est associée à une augmentation de la méthylation de l'ADN. Ces données nous ont permis de concevoir des modificateurs de l'épigénome pour manipuler l'architecture épigénétique des promoteurs de HBG et des enhancers de BCL11A afin d'atteindre des niveaux thérapeutiques d'HbF.

B-thalassemia and sickle cell disease (SCD) result from mutations that affect the synthesis or structure of adult hemoglobin. Historically, allogeneic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation from a compatible donor was the only curative treatment. Transplantation of autologous, genetically modified HSCs offers a promising therapeutic alternative for patients lacking a suitable donor. The clinical severity in b-hemoglobinopathies is mitigated by co-inheritance of hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH), a benign condition characterized by mutations occurring in the genes encoding the fetal y-globin chains, which lead to increased fetal hemoglobin (HbF, a2y2) expression, which can rescue the b-thalassemic and SCD phenotypes. HbF reactivation can be achieved by down-regulating BCL11A, encoding a key repressor of HbF. A CRISPR/Cas9 strategy targeting the GATA1 binding site (BS) within the +58-kb erythroid-specific enhancer of BCL11A has recently been approved as the first gene-editing therapy for b-thalassemia and SCD. Indeed, the targeting of the BCL11A erythroid-specific enhancer led to an efficient reduction of BCL11A in the erythroid cells, without impacting the differentiation of HSPCs in the other cell lineages. However, site-specific nucleases induce double strand breaks (DSBs), posing significant risks, such apoptosis and generation of large genomic rearrangements. In addition, to obtain an adequate number of corrected cells to transplant, several collections of HSCs are necessary to compensate for the cell loss due to DSB-induced apoptosis. Finally, the clinical study showed variability in the extent of HbF reactivation, still high HbS levels and modest correction of ineffective erythropoiesis. Novel CRISPR/Cas9 derived tools are currently available and can be used to develop therapeutic strategies associated with a low risk of DSB generation and increased HbF expression. In this project, we intend to develop universal, safe and efficacious therapeutic strategies for b-hemoglobinopathies aimed at modifying HSCs using base editors (BEs) and epigenome editors to reactivate HbF expression in their erythroid progeny. BEs are a CRISPR-Cas9-based genome editing technology that allows the introduction of point mutations with little DSB generation. In this work we used this technology to inactivate the GATA1 or the ATF4 transcriptional activator BS in the +58-kb and +55-kb BCL11A erythroid-specific enhancers through the insertion of point mutations. In particular, to reach levels of HbF sufficient to rescue the sickling phenotype, we performed simultaneous targeting of the two BS, achieving similar HbF levels compared to CRISPR/Cas9 nuclease-based approach. Additionally, we showed that BEs generated fewer DSBs and genomic rearrangements compared to the CRISPR/Cas9 nuclease approach. In parallel, we developed a novel epigenome-editing strategy aimed at modulating gene expression without altering the DNA sequence (e.g. without generating DSBs). We designed two approaches to upregulate HbF expression: a first strategy targeting and activating the y-globin promoters and a second approach downregulating BCL11A by targeting its erythroid-specific enhancers. We first identified the epigenetic marks in these trans- and cis-regulatory regions that are associated with active or inactive transcription in adult versus fetal erythroid cells. Then we used epigenome editors to deposit active histone modifications at the y-globin promoters and remove inactive marks such as DNA methylation. In parallel, we decorated the BCL11A enhancers with inactive epigenetic marks. Preliminary results demonstrated y-globin reactivation using both strategies, though the effects diminished over time, indicating the need for further optimization. In conclusion, we proposed two different editing approaches that allow to reduce DSB-associate issues as strategies to treat b-hemoglobinopathies.