Stratégies pour améliorer in vivo la survie des cellules stromales mésenchymateuses dans le traitement de l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive

Strategies for efficient and long-term engraftment of Mesenchymal Stromal Cells for the treatment of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa

• Auteur / Autrice : Mathilde Bonnet des Claustres
• Direction : Alain Hovnanian, Sonia Gaucher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 03/12/2024
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Jérôme Larghero
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Zhenlin Li, Hervé Petite, Ara Parlakian
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marina-Laurie Trouillas, Nathalie Chevallier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Épidermolyses bulleuses dystrophiques

Thérapeutique cellulaire

Cellules stromales mésenchymateuses

Mots clés libres

Cellules stromales mésenchymateuses

Thérapie cellulaire

Épidermolyse bulleuse dystrophique récessive

Mesenchymal stromal cell

Cell therapy

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa

Résumé

L'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) est une maladie génétique cutanée grave causée par des mutations de perte de fonction dans le gène COL7A1 codant pour le collagène VII (C7). Les patients atteints d'EBDR souffrent depuis la naissance de bulles sur la peau et les muqueuses et développent des complications locales et générales sévères, ce qui entraîne un mauvais pronostic. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont démontré un potentiel d'amélioration de la cicatrisation et de l'inflammation cutanée chez les patients atteints d'EBDR via leur capacité à exprimer le C7 et leurs propriétés anti-inflammatoires. Le but de ce travail est d'optimiser le conditionnement in vitro des CSM dérivées de la moelle osseuse humaine (CSM-MO) afin d'améliorer leur survie après injection dans des modèles murins. Tout d'abord, des CSM-MO de donneurs sains ont été transduites avec un vecteur lentiviral codant pour les protéines reportrices firefly luciferase et mCherry, sans altérer leur phénotype de CSM. Ensuite, les CSM-MO Fluc+/mCherry+ ont été soumises à différentes conditions de culture : (1) en milieu supplémenté en sérum de veau foetal ou en lysat plaquettaire humain, (2) la culture en monocouche sur plastique ou en sphéroïdes et (3) en hypoxie (5% O2) ou en normoxie (21% O2). Ensuite, ces cellules ont été injectées par voie intraveineuse (IV) ou intradermique (ID) dans des modèles murins. Leur survie in vivo et leur biodistribution ont été évaluées par imagerie in vivo. Comme indiqué dans la littérature, nous avons observé qu'après une injection IV, une majorité de CSM-MO était séquestrées dans les poumons. Cependant, une fraction de CSM-MO est capable de s'échapper des poumons et est détectée dans les reins avant d'être éliminé dans les urines. L'échappement à la séquestration pulmonaire semble être favorisé par les conditions de culture en sphéroïdes. En effet, 24 heures après l'injection, le signal de luminescence détecté dans les reins pour les CSM-MO en culture monocouche correspond au signal observé en culture sphéroïde dès 3 heures après l'injection. Par ailleurs, des résultats précédents ont montré que les CSM-MO injectées par voie ID avaient une durée de vie de 4 mois dans des conditions de culture in vitro standard. Cependant, bien que la plupart des CSM-MO injectées soient mortes au cours des deux premiers mois pour toutes les conditions testées, une sous-population (10 %) de CSM-MO a persisté entre 35 à 61 semaines après l'injection. Nous avons prélevé des échantillons de peau murine dans lesquelles avaient été injectées en ID des CSM-MO, deux mois après l'injection et analysé la sous-population survivante par immunomarquage et transcriptomique spatiale. En parallèle, nous avons analysé les CSM-MO cultivées dans les différentes conditions avant l'injection par séquençage de l'ARN en single-cell (scRNAseq). Nos résultats indiquent que les cellules survivantes étaient initialement présentes dans la population cellulaire injectée. Les données transcriptomiques spatiales indiquent que ces cellules survivantes maintiennent l'expression de THY1, ENG et NT5E in vivo et partagent plusieurs caractéristiques avec les fibroblastes cutanés. Elles expriment COL7A1 et ont une expression enrichie en gènes impliqués dans les constituants de la matrice extracellulaire, l'organisation des fibres de collagène ce qui présente une option thérapeutique importante pour la cicatrisation des plaies. L'identification et la caractérisation de cette sous-population distincte de CSM-MO capable de survivre à long terme après l'injection ID permettrait proposer des protocoles de thérapie cellulaire améliorés pour l'EBDR avec des effets durables.

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) is a severe skin disease caused by loss-of-function mutations in COL7A1 encoding type VII collagen (C7). Patients with RDEB suffer since birth from skin and mucosal blistering and develop severe local and systemic complications resulting in poor prognosis. Mesenchymal stromal cells (MSC) demonstrated potential to improve wound healing and skin inflammation in RDEB patients due to their capacity to express C7 and their anti-inflammatory properties. The aim of this work is to optimize in vitro conditioning of human bone marrow-derived MSC (hBM-MSC) to improve their survival following injection in murine models. First, hBM-MSC from healthy donors were transduced with a lentiviral vector encoding firefly luciferase and mCherry reporter proteins, without altering their MSC phenotype. Then, hBM-MSC Fluc+/mCherry+ were subjected to various culture conditions: (1) culture in monolayer on plastic or in spheroids, (2) in medium supplemented with fetal calf serum or supplemented with human platelet lysate and (3) in hypoxia (5% O2) or in normoxia (21% O2). Next, these cells were injected intradermally (ID) or intravenously (IV) in murine models. Their in vivo survival and biodistribution were assessed using the bioluminescent reporter through in vivo imaging. As reported in the literature, we observed that following IV injection a majority of hBM-MSC were entrapped in the lungs. However, a fraction of hBM-MSC is able to escape the lungs and is detected in the kidneys before being eliminated in the urine. Interestingly, escape from the lungs seems to be favored by the spheroid cell culture condition. At 24 hours post-injection, the luminescence signal detected in the kidneys for hBM-MSCs in monolayer culture matches the signal observed in spheroid culture as early as 3 hours post-injection. Moreover, previous results have shown 4 months of survival of ID-injected BM-MSCs cultured under standard in vitro culture conditions. Nevertheless, although most injected cells died within the first two months in all tested conditions, a small population (10%) of live bioluminescent cells persisted for 35 to 61 weeks post-injection. We sampled murine skins injected with the hBM-MSC two months post injection and analyzed the surviving subpopulation by immunostaining and spatial transcriptomic. In parallel we analyzed the hBM-MSC populations cultured under the different conditions prior to injection through single-cell RNA sequencing (scRNAseq). Our results indicated that the surviving cells were initially present in the injected cell population. Spatial transcriptomics data indicated that these surviving cells maintained the expression of THY1, ENG and NT5E in vivo and shared several characteristics with cutaneous fibroblasts. They expressed COL7A1 and showed enriched expression of genes involved in extracellular matrix structural constituent, collagen fibril organization which have substantial therapeutic value for wound healing. The identification and characterization of this subpopulation of hBM-MSC capable of long-term survival following ID injection would enable us to propose improved cell therapy protocols for RDEB with long-lasting effects.