Bulles dendritiques comme un nouveau MTOC spécifique à la classe I dans les neurones ddaE de drosophila melanogaster

Dendritic bubbles as a novel class I-specific MTOC in drosophila melanogaster ddaE neurons

• Auteur / Autrice : Adrià Chorro I Satorra
• Direction : Paul Conduit
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurobiologie
• Date : Soutenance le 29/11/2024
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Jacques Monod (Paris ; 1997-....)
• Jury : Président / Présidente : Juliette Azimzadeh
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Filippo Del Bene
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Coralie Fassier, Jens Lüders

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dendrites

Drosophila melanogaster

Microtubules

Mots clés libres

Microtubules

Drosophila melanogaster

Classe I neurones

MTOC distal

Bulles dendritiques

Cnn

G-TuRCs

Microtubules

Drosophila melanogaster

Class I neurons

Distal MTOC

Dendritic bubbles

Cnn

G-TuRCs

Résumé

Les microtubules sont des polymères polarisés dont les extrémités plus sont plus dynamiques que les extrémités moins. Dans les neurones, les microtubules favorisent la croissance, la stabilité et la ramification des neurites. L'organisation des microtubules est cruciale pour la polarité cellulaire, car elle guide le transport de cargaisons intracellulaires entre le soma et les neurites vers les extrémités plus ou moins. Les axones ont une grande majorité de microtubules à extrémité plus, tandis que les dendrites ont des microtubules à extrémité moins, ce qui est essential pour différencier l'identité entre axons et dendrites. Cependant, savoir comment cette distribution de la polarité est établie et maintenue reste une question sans réponse dans ce domaine. La nucléation des microtubules, étant cinétiquement défavorable dans les cellules, est catalysé par les complexes multiprotéiques gamma-TuRCs, qui sont recruté par des protéines d'ancrage comme la Centrosomin (Cnn), vers des centre d'organisation des microtubules (MTOC). Les microtubules nucléés à partir des gamma-TuRCs dans ces MTOC influencent ainsi la polarité cellulaire. Cette thèse utilise les neurones d'arborisation dendritique (da) des larves de Drosophila melanogaster, notamment les neurones proprioceptifs de classe I. L'objectif de cette thèse est de comprendre comment les microtubules sont organisés dans les neurones de classe I pour générer la polarité des extrémités moins de l'arborisation dendritique. Des résultats antérieurs ont montré que les gamma-TuRCs se localisent dans ces structures des dendrites de classe I que nous appelons bulles dendritiques. Cette localisation spécifique soulève la question de savoir si ces bulles sont des sites potentiels de nucléation et/ou d'ancrage des microtubules, ce qui pourrait contribuer à établir et à maintenir la polarité des microtubules à l'extrémité moins. J'ai donc caractérise la présence de bulles dendritiques dans les neurones de classe I et j'ai découvert que les bulles dendritiques sont distribuées le long des dendrites secondaires, avec une concentration accrue dans les régions distales. Pour déterminer si ces bulles sont des MTOC, j'ai quantifié la localisation des g-TuRCs, en utilisant une ligne endogène de gamma-Tubulin-GFP. J'ai constaté que la gamma-Tubulin-GFP tend à se concentrer dans les points de branchement et les bulles dendritiques. En conséquence, j'ai quantifié les événements de croissance des microtubules en utilisant un marquer d'extrémité plus, EB1-GFP, montrant des comètes de microtubules dynamiques émergeant des bulles dendritiques aussi fréquemment que des points de branchement, ce qui démontre que les bulles son un site de nucléation avec une dynamique régulière des microtubules à des stades de développement larvaire tardifs. J'ai découvert que les extrémités moins des microtubules et des protéines centrosomales, telles que Cnn, Plp et Ninein, se concentrent dans les bulles dendritiques distales, formant un MTOC qui établit un réseau de microtubule polarisé dans les dendrites. En éliminant les facteurs connus, j'ai démontré l'existence d'un mécanisme complexe contrôlant la formation du MTOC dans les bulles dendritiques ainsi que l'accumulation des extrémités moins dans les régions distales. Un autre régulateur des extrémités moins chez Drosophila melanogaster est la protéine Patronin, qui empêche la croissance des extrémités moins dans les dendrites. La déplétion de Patronin dans les neurones de classe I entraîne une réduction des extrémités moins dans les bulles dendritiques, ce qui montre qu'il existe une tendance à transporter les extrémités moins coiffées par Patronin vers les bulles dendritiques distales pour ancrer les microtubules dans le MTOC distal. Les neurones de classe I utilisent ainsi un mécanisme pour maintenir la polarité d'extrémité moins dans leurs dendrites pendant le développement.

Microtubules are polarized polymers with plus-ends that are typically more dynamic than minus-ends. Microtubule network organisation plays a crucial role in determining cell polarity, as specific motors transport-specific cargo towards either plus or minus ends. In neurons, microtubules promote neurite growth, stability and branching: serving as structural support or tracks for the transport of intracellular cargo, between the soma and the neurite terminals. Axons have a vast majority of plus-end-out microtubules, while dendrites contain many minus-end-out microtubules. This difference is essential to define axon and dendrite identity. However, knowing how this distribution in microtubule polarity is established and maintained remains an important unanswered question in the field. Since microtubule nucleation is kinetically unfavourable within cells, this process is templated and catalysed by the multi protein gamma-Tubulin Ring Complexes (gamma-TuRCs), which are recruited by tethering proteins, such as Centrosomin (Cnn), to specific Microtubule Organising Centres (MTOCs). Microtubules nucleated from gamma-TuRCs at these MTOCs grow with their plus ends leading, thus, influencing microtubules and cell polarity. In this thesis, I am using Drosophila melanogaster larval dendritic arborisation (da) neurons, a popular in vivo model, which are divided in a cluster of neurons, including the proprioceptive Class I neurons. The goal of this thesis is to understand how microtubules are organised in Class I da neurons to generate the overall minus-end-out polarity within the dendritic arbour. Previous results showed that gamma-TuRCs localise within specific swellings of Class I dendrites that we call dendritic bubbles. This specific location raises the question of whether these dendritic sites are potential sites for microtubule nucleation and/or anchoring, which could help establish and maintain minus-end-out microtubule polarity. So, I have meticulously characterised the presence of dendritic bubbles within Class I da neurons and found that dendritic bubbles are distributed along secondary dendrites, with higher concentration of bubbles in distal regions of the dendrite. To explore whether these bubbles are indeed MTOCs, I examined and carefully quantified the localisation of gamma-TuRCs, using an endogenously-tagged gamma-Tubublin-GFP fly line. I found that gamma-Tubulin-GFP tends to concentrate in branchpoints and dendritic bubbles. Consistent with this, I quantified microtubule growth events using a plus-end marker known as EB1-GFP to show dynamics microtubule comets emerging from dendritic bubbles as frequently as in branchpoints, demonstrating that dendritic bubbles are a nucleation site with regular microtubule dynamics at late larval developmental stages. Moreover, I have also found that microtubule minus-ends and several centrosomal proteins; like Cnn, Pericentrin-like-Protein (PLP) and Ninein; concentrate within distal dendritic bubbles, conforming a MTOC within the dendritic arbour to established a polarised microtubule network. Depleting all known factors, I demonstrate that there is an intricate mechanism for controlling the MTOC formation within dendritic bubbles as well as accumulating minus ends towards distal regions of the dendrite. Apart from gamma-TuRCs, another regulator for minus ends in Drosophila melanogaster is the minus-end targeting protein Patronin, which prevents minus-end growth within dendrites. Depletion of Patronin from Class I da neurons results in minus-end reduction within distal dendritic bubbles, showing that exists a tendency for transporting Patronin-capped minus-ends towards distal dendritic bubbles to anchor microtubules in the distal MTOC. This would provide Class I da neurons a mechanism to promote and maintain minus-end-out polarity in Class I in dendrites during developmental stages.