Caractérisation de deux éléments génétiques mobiles de Bacteroides abritant des rétroéléments générateurs de diversité (DGR)

Characterization of two Bacteroides mobile genetic elements harboring diversity-generating retroelements (DGR)

• Auteur / Autrice : Sol Vendrell Fernández
• Direction : Jean-Marc Ghigo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 26/09/2024
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique des biofilms (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Microbiologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Martin-Verstraete
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Colin Hill, Jean-Paul Motta
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Agnès Petit, Pascale Boulanger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rétroéléments

Bacteroides thetaiotaomicron

Îlots génomiques

Mots clés libres

Bacteroides thetaiotaomicron

Élément rétroactif générateur de diversité (DGR)

Hankyphage

Pili de type V

Élément conjugatif intégratif (ICE)

Bacteroides thetaiotaomicron

Diversity-Generating retroelement (DGR)

Hankyphage

Type V pili

Integrative conjugative element (ICE)

Résumé

Les Bacteroides spp sont des symbiotes intestinaux humains particulièrement bien adaptés à l'environnement intestinal grâce à leur grande capacité à utiliser les polysaccharides et à adhérer aux surfaces intestinales. Ce genre bactérien héberge également de nombreux éléments génétiques mal compris qui pourraient contribuer à leur survie et à leur persistance dans l'intestin. Parmi ces éléments, on trouve les rétroéléments générateurs de diversité (DGRs), qui mutent les régions cibles de l'ADN bactérien et des bactériophages à une fréquence élevée grâce à un processus dépendant de la transcriptase inverse. Alors qu'il a été démontré que les DGR associés aux bactériophages introduisent des mutations dans les séquences des protéines de liaison des récepteurs phagiques, ce qui permet une adaptation aux modifications des ligands de l'hôte, les DGR présent dans les génomes bactéries n'ont pratiquement pas été étudiés. Au cours de mon doctorat, j'ai étudié à la fois un DGR associé à un phage et un DGR associé à une bactérie. L'objectif principal de ma thèse de doctorat a été d'étudier les structures potentiellement ciblées par les DGR situés dans les éléments mobiles. J'ai d'abord exploré la transition lysogénique-lytique du Hankyphage, un phage de Bacteroides remarquablement répandu mais peu étudié, contenant un DGR. J'ai caractérisé une collection de Hankyphages de B. thetaiotaomicron et contribué à déterminer que les phylogénies du Hankyphage et des Bacteroides sont divergentes, indiquant une activité et une transmission horizontale du Hankyphage. J'ai ensuite développé une méthode utilisant la PCR digitale en gouttelettes pour quantifier les virions non lytiques et et construit différentes variantes de la souche de B. thetaiotaomicron portant des Hankyphages pour étudier le cycle lytique-lysogénique du phage. J'ai montré que les virions de Hankyphage étaient produits en l'absence d'inducteurs et j'ai identifié un répresseur de type CI responsable de l'inhibition du cycle lytique du Hankyphage de B. thetaiotaomicron. De plus, j'ai observé une absence généralisée de formation de plaques et de lysogénisation secondaire qui pourrait être partiellement expliquée par des défauts structurels du phage conduisant à la production de particules défectueuses à une fréquence élevée, observée par microscopie électronique à transmission. Globalement, cette étude a fourni de nouvelles informations biologiques sur la régulation du cycle lytique des Hankyphages, un bactériophage très répandu dans les Bacteroides. Au cours de ma thèse, j'ai également étudié un DGR associé au chromosome ciblant la protéine située à l'extrémité d'un pilus de type V, dont les gènes sont localisés dans une région potentielle d'élément conjugué intégratif (ICE). Bien que j'aie montré que cette région est transcriptionnellement silencieuse et non mobile dans des conditions de laboratoire, même après l'ajout de différents inducteurs, des expériences d'expression en trans ont montré que ce pilus de type V pouvait être correctement assemblé et exposé à la surface bactérienne. J'ai ensuite étudié les partenaires de liaison potentiels ou les préférences de ligand du pilus, afin de mieux comprendre le rôle des pili de type V encore mal caractérisés chez les Bacteroides. Enfin, j'ai également étudié les déterminants de la formation de biofilm par B. thetaiotaomicron en contribuant à montrer que la bile induit la formation de biofilm et qu'une DNase extracellulaire et l'efflux d'ions magnésium sont nécessaires pour la réponse à la bile. Dans l'ensemble, ce travail a fourni de nouvelles perspectives sur la régulation des éléments mobiles associés aux DGRs chez les Bacteroides et a contribué à une meilleurr compréhension de la formation de biofilm en réponse à un signal intestinal. Ces travaux ouvrent la voie à de futures études sur le rôle des DGRs et le comportement communautaire dans l'environnement intestinal.

Bacteroides are prominent human gut symbiont anaerobes particularly well adapted to the intestinal environment via their vast polysaccharide utilization capacity and adhesion potential to gut surfaces. This genus also harbors many of ill-understood genetic elements that might contribute to their survival and persistence in the gut. One of such elements are diversity generating retroelements (DGRs), which mutate target regions of bacterial and bacteriophage DNA at a high frequency through a reverse transcriptase-dependent process. Whereas bacteriophage-associated DGRs have been shown to mutate receptor binding proteins, allowing adaptation to host ligand changes, bacterial-associated DGRs have been mostly unexplored. The main objective of my PhD thesis was to study structures potentially targeted by DGRs located within mobile elements. I first explored the lysogenic-lytic transition of the Hankyphage, a remarkably widespread, yet ill-understood Bacteroides phage containing a DGR. I characterized a collection of B. thetaiotaomicron Hankyphages and contributed to determine that the Hankyphage and Bacteroides phylogenies are divergent, indicative of Hankyphage activity and horizontal transmission. Moreover, I developed a digital-droplet PCR-based method to quantify non-lytic virions and constructed different variants of B. thetaiotaomicron strain carrying Hankyphages to study the phage lytic-lysogenic cycle. I showed that Hankyphage virions were produced in absence of inducers and identified a CI-like repressor responsible for inhibiting the B. thetaiotaomicron Hankyphage lytic cycle. Additionally, I observed a generalized lack of plaque formation and secondary lysogenization that could be partly explained by phage structural defects leading to the production of defective particles to a high frequency. Altogether, this study provided new biological insights on the regulation of the lytic cycle a broad-range Hankyphages widespread in Bacteroides. During my PhD thesis, I also studied a chromosomally-associated DGR targeting the tip protein of a type V pilus located within a potential integrative conjugative element (ICE) region. Whereas I showed that this region is transcriptionally silent and non-mobile in laboratory conditions, even upon addition of different inducers, in trans expression experiments showed that this type V pilus could be properly assembled and exposed at the bacterial surface and I investigated potential binding partners or ligand preferences of the pilus, aiming at providing a better understanding of the role of the still ill-characterized type V pili in Bacteroides. Lastly, I also studied the determinant of B. thetaiotaomicron biofilm formation by contributing to show that bile induced biofilm formation and that an extracellular DNase and the efflux of magnesium ions were required for the response to bile. Overall, this work has provided new insights on the regulation of DGR-associated Bacteroides mobile elements and contributed to the mechanistic understanding of biofilm formation in response to a relevant gut cue. This hopefully paves the way for future studies investigating the role of DGRs and community-like behaviour in the intestinal environment.