Analyse du trafic vésiculaire et de la sécrétion de la chimiokine CCL2 dans les mastocytes après activation par le FceRI

Analysis of CCL2 chemokine vesicular trafficking and secretion in FceRI-activated mast cells

• Auteur / Autrice : Juan Eduardo Montero Hernandez
• Direction : Ulrich Blank
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 30/09/2024
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche sur l'inflammation (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Gaël Ménasché
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Dudeck, Oliver Nüsse

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vésicules de transport

Chimiokines

Mastocytes

Mots clés libres

Mastocytes

IgE

CCL2

CCL2-EGFP

Trafic vésiculaire

VAMP7

VAMP3

Cytosquelette

Protéoglycanes

Inflammation

Mast Cell

IgE

CCL2

CCL2-EGFP

Vesicular traffic

VAMP7

VAMP3

Cytoskeleton

Proteoglycan-bound CCL2

Inflammation

Résumé

Dans ce travail de thèse j'ai étudié le trafic vésiculaire conduisant à la sécrétion de la chimiokine CCL2 et d'une protéine de fusion CCL2-eGFP dans des mastocytes (MC) dérivés de progéniteurs de moelle osseuse ou de cellules péritonéales de souris de type sauvage (WT) ou transgéniques CCL2-eGFP, stimulés par leur récepteur de haute affinité pour l'IgE (Fc'RI). Les MC WT et CCL2-eGFP ont d'abord libéré la chimiokine préstockée, suivie d'une deuxième vague de sécrétion de CCL2 et CCL2-eGFP nouvellement synthétisées avec une cinétique comparable, bien que la protéine de fusion semble être sécrétée moins efficacement. Nos données montrent leur colocalisation partielle avec les endosomes de recyclage VAMP3+ et les endosomes tardifs VAMP7+ suggérant que ces endosomes sont des intermédiaires du trafic vésiculaire du CCL2 sécrété. En accord, la sécrétion de CCL2 est partiellement inhibée dans les MC VAMP7 KO. L'analyse dynamique du trafic vésiculaire de CCL2-eGFP a révélé un mode de sécrétion complexe et diversifié (multidirectionnel, polarisé ou type pseudopode) qui dépend de l'interaction étroite entre les cytosquelettes d'actine et des microtubules. Après sécrétion, la CCL2-eGFP interagit avec les protéoglycanes libérés par dégranulation. Dans une configuration de dégranulation polarisée, la libération précoce de la CCL2-eGFP se fait dans l'interface de dégranulation, et la sécrétion tardive de la CCL2 nouvellement synthétisée montre un trafic multidirectionnel principalement loin de l'interface de dégranulation. In vivo, lors d'une réaction anaphylactique cutanée passive IgE-dépendante, la CCL2 apparait au cours de la première vague de sécrétion dans la circulation alignée sur les vaisseaux probablement en se liant aux protéoglycanes endothéliaux, alors que pendant la deuxième vague la CCL2 sécrétée se retrouve également dans le tissu. Ces deux vagues pourraient jouer un rôle pour attirer au mieux les cellules inflammatoires localement à la fois au niveau vasculaire et tissulaire. Notre étude fournit de nouvelles informations sur la manière dont les MC organisent le site inflammatoire.

In this thesis work I investigated the vesicular trafficking and secretion of the CCL2 chemokine and of a CCL2-eGFP fusion protein in IgE-activated cultured mast cells (MC) derived from the bone marrow or the peritoneum of wild-type (WT) and of newly generated CCL2-eGFP mice. Both WT and CCL2-eGFP MC released significant amounts of prestored CCL2, followed in a second wave by the secretion of newly synthesized CCL2 and CCL2-eGFP with comparable kinetics, albeit the latter appeared to be secreted less efficiently. CCL2 partially colocalized in VAMP3- and VAMP7-positive vesicles, and secretion of CCL2 was partially impaired in cultured MC from VAMP7 KO mice, suggesting the use of distinct vesicular carriers. Dynamic imaging of CCL2-eGFP trafficking revealed a complex (multidirectional, polarized or pseudopodia-directed) secretion pattern that depended on the interplay between the actin and microtubule cytoskeletons. Upon secretion, CCL2-eGFP interacted with the proteoglycan matrix released by degranulation. In a polarized degranulation assay, CCL2-eGFP was directed towards the degranulation interface in the early phase, whereas newly synthesized CCL2-eGFP was secreted multidirectionally, trafficking predominantly away from the degranulation interface. In vivo, during an IgE-driven passive cutaneous anaphylaxis response, CCL2 appeared in the circulation lining blood vessels, likely by binding to endothelial cell-expressed proteoglycans during the first wave of degranulation, while the second wave of newly synthesized CCL2 secretion showed tissue localization, both supporting a role for local attraction at the site of inflammation. Our study provides new insights into how MC enable local recruitment of inflammatory cells to the vasculature and tissues.