Impact de la modification epitranscriptomique m6A sur la structure de l'ARN du VIH-1

Epitranscriptomic impact of m6A modification on HIV-1 RNA structure

• Auteur / Autrice : Valerii Martynov
• Direction : Bruno Sargueil
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie
• Date : Soutenance le 23/09/2024
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cibles thérapeutiques et conception de médicaments (Paris ; 2019-....)
• Jury : Président / Présidente : Mélanie Ethève-Quelquejeu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Théophile Ohlmann
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Christophe Paillart, Eugénia Basyuk

Mots clés

Mots clés contrôlés

Adénosylméthionine

ARN viral

Protéines recombinées

ARN

VIH (virus)

Mots clés libres

M6a

Vih-1

Arn

Structure

M6a

Hiv-1

Rna

Structure

Résumé

La modification de l'ARN en position N6 (m6A) est la modification co/post-transcriptionnelle la plus abondante, jouant un rôle essentiel dans la régulation fonctionnelle des ARN cellulaires. La m6A est impliquée dans les infections virales et la réponse immunitaire. Il a été mis en évidence que l'ARN génomique du VIH-1 est principalement méthylé dans les régions 5' et 3' non traduites, ce qui modifie la réplication du VIH-1 à différentes étapes. Toutefois, les différents rapports sont contradictoires, et les mécanismes impliqués sont mal compris. Cela provient en partie du manque de précision des méthodes de détermination des sites de méthylation. Par ailleurs, l'influence de ces modifications sur la structure de l'ARN viral n'a jamais été prise en compte. Ainsi, j'ai mis en place une méthodologie efficace pour l'expression de protéines recombinantes dans des cellules d'insectes au sein du laboratoire. Cela m'a permis de purifier le complexe enzymatique des protéines METTL3/14 afin de reproduire la méthylation m6A in vitro. De plus, mon projet propose une approche novatrice en chimie-biologie pour cartographier les sites de m6A en utilisant la METTL3/14 recombinante et un allyl-analogue du donneur de méthyl, la S-Adénosylméthionine (SAM), avec une grande précision au sein de la 5'UTR du VIH-1. En appliquant la technique d'acylation sélective de 2 'hydroxyle analysée par primer extension (SHAPE) sur l'ARN de la 5'UTR du VIH-1, méthylé ou non méthylé, j'ai pu mettre en évidence des différences significatives compatibles avec un modèle de « switch » structurel de l'ARN du VIH-1. J'ai également évalué les effets potentiels de ces modifications sur les processus de dimérisation et de traduction de l'ARN viral, qui seraient supposément régulés par des changements dans la structure de l'ARN. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels la m6A régule la réplication du VIH-1.

Modification of RNA at the N6 position (m6A) is the most prevalent modification that occurs during/after transcription, and it is crucial for regulating the functionality of cellular RNAs. m6A is involved in viral infections and immune response. Methylation of HIV-1 genomic RNA is mostly observed in the 5' and 3' untranslated regions, resulting in modifications to HIV-1 replication at various stages. However, different reports are contradictory, and the mechanisms involved are poorly understood. Partly, this can be attributed to the imprecision in techniques used to identify methylation sites. Moreover, the impact of these alterations on the structure of viral RNA has never been taken into account. Thus, I have established an efficient methodology for the expression of recombinant proteins in insect cells in the laboratory. This allowed me to purify the METTL3/14 protein enzymatic complex in order to reproduce m6A methylation in vitro. This project presents a new chemistry-biology method to accurately identify m6A sites in the HIV-1 5'UTR by employing recombinant METTL3/14 and an allyl-analogue of the methyl donor, S-Adenosylmethionine (SAM) with high precision within the HIV-1 5'UTR. By applying the selective 2¿ hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) on methylated and unmethylated HIV-1 5'UTR RNA, I successfully identified significant variations that appear to be consistent with an HIV-1 RNA structural switch model. I also evaluated the potential effects of these modifications on viral RNA dimerization and translation processes, which are supposedly regulated by changes in RNA structure. These results contribute to a better understanding of the mechanisms by which m6A regulates HIV-1 replication.