Qualification fonctionnelle du tissu ovarien cryoconservé

Functional qualification of cryopreserved ovarian tissue

• Auteur / Autrice : Sophie Franck-Frontczak
• Direction : Frédéric Grenouillet, Florence Scheffler
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Médecine, cancérologie, génétique, hématologie, immunologie
• Date : Soutenance le 13/12/2024
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Interactions hôte-greffon-tumeur et ingénierie cellulaire et tissulaire (RIGHT) (Besançon) - Interaction hôte-greffon-tumeur, ingénierie cellulaire et génique
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université de Franche-Comté (1971-2024)
• Jury : Président / Présidente : Rajeev Ramanah
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Béatrice Delepine
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rosalie Cabry-Goubet, Marius Teletin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Autoplastie

Cryobiologie

Ovaire

Tissus (histologie)

Préservation de la fertilité

Cytométrie de flux

Mots clés libres

Cytométrie en flux

Préservation de la fertilité

Tissu ovarien

Cryobiologie

Flow cytometry

Fertility preservation

Ovarian tissue

Cryobiology

Résumé

Résumé : Chez les patientes pour lesquelles un traitement hautement gonadotoxique ne peut être différé dans le cadre d’une pathologie néoplasique ou non, l’autoconservation de tissu ovarien (CTO) et la réutilisation par technique d’autogreffe sont les seules options ayant faire preuve de leurs efficacités. Cependant, l’autogreffe de tissu ovarien présente deux limites majeures. La première concerne le risque de réintroduction de cellules néoplasique par le biais des greffons, nécessitant une recherche de la maladie résiduelle dans le tissu. La deuxième concerne la qualité des greffons tant en nombre de follicules pré-antraux présents ayant survécu à la congélation/décongélation qu’en nombre de cellules stromales de qualité permettant le développement folliculaire ou encore la revascularisation des greffons après autogreffe.L’objectif de ce travail a été de participer à la validation d’une technique de qualification fonctionnelle du tissu ovarien cryoconservé en s’articulant sur deux parties.Une première partie consistait à valider une technique de congélation automatisée afin d’optimiser et de standardiser la procédure, en évaluant la viabilité folliculaire après décongélation du tissu ovarien. Il n’a pas été mis en évidence de différence significative entre les différents modes de congélation. La qualité en termes de viabilité n’était pas altérée par le nouveau protocole qui est standardisé, plus sure et plus rapide. Une seconde partie consistait à valider d’une technique de caractérisation et de qualification fonctionnelle du tissu ovarien dans le but d’identifier des sous populations cellulaires d’intérêt. Après dissociation du tissu ovarien, les cellules ovariennes obtenues ont été analysées par cytométrie en flux multicouleurs (CMF) permettant de déterminer le rendement et la viabilité cellulaire après dissociation ainsi que la recherche de marqueurs spécifiques de sous populations cellulaires. Le rendement était significativement supérieur après dissociation de tissu ovarien frais en comparaison au tissu ovarien congelé. En revanche, la viabilité était significativement supérieure après dissociation du tissu ovarien congelé par rapport au tissu ovarien frais. L’utilisation d’un panel d’anticorps a permis d’identifier différentes sous populations pouvant correspondre aux cellules ou progéniteurs endothéliaux, aux cellules ayant un profil mésenchymateux et aux péricytes.Bien que la mise au point du panel doive être poursuivie, la CMF a démontré son efficacité dans la caractérisation des populations de cellules au sein du tissu ovarien. Cette technique pourrait à termes permettre d’identifier d’éventuels marqueurs pronostiques de réussite de l’autogreffe de tissu ovarien, des populations d’intérêt dans des modèles de reconstruction ovarienne ou encore de permettre de réaliser simultanément une qualification carcinologique et fonctionnelle des greffons.

Abstract: In patients for whom highly gonadotoxic treatment cannot be deferred, whether due to neoplastic or non-neoplastic pathology, ovarian tissue cryopreservation and reuse by autograft technique are the only options with proven efficacy. However, ovarian tissue autografting has two major limitations. The first concerns the risk of reintroduction of neoplastic cells via the grafts, which requires a search for residual disease in the tissue. The second concerns the quality of the grafts, both in terms of the number of pre-antral follicles present that have survived freezing/thawing, and the number of quality stromal cells that allow follicular development or revascularization of the grafts after autografting.The aim of this work was to validate a functional qualification technique for cryopreserved ovarian tissue in two parts.The first part consisted in the validation of an automated freezing technique to optimize and standardize the procedure. Follicular viability was evaluated after thawing of ovarian tissue. No significant differences were found between the different freezing methods. The quality in terms of viability was not altered by the new protocol, which is standardized, safer and faster. The second part consisted in the validation of a technique for the characterization and functional qualification of ovarian tissue. The aim was to identify cell subpopulations of interest. After dissociating the ovarian tissue, the ovarian cells obtained were analyzed using multicolor flow cytometry (MFC) to determine cell yield and viability after dissociation and to search for specific markers of cell subpopulations. Yield was significantly higher after dissociating fresh ovarian tissue compared to frozen ovarian tissue. On the other hand, viability was significantly higher after dissociating frozen compared to fresh ovarian tissue. Different subpopulations corresponding to endothelial or progenitor cells, cells with a mesenchymal profile and pericytes could be identified using a panel of antibodies. CMF has demonstrated its efficacy in characterizing cell populations within ovarian tissue, although further development of the panel is required. Eventually, this method may identify potential prognostic markers for the success of ovarian tissue autograft, populations of interest for ovarian reconstruction modeling, or simultaneous cancer and functional qualification of transplants.