Caractérisation de la sélection in vitro de la résistance aux artémisinines chez Plasmodium falciparum

Characterization of the in vitro selection of artemisinins resistance in Plasmodium falciparum

• Auteur / Autrice : Marion Laurent
• Direction : Lucie Paloque, Jean-Michel Augereau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacologie
• Date : Soutenance le 28/10/2024
• Etablissement(s) : Université de Toulouse (2023-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de délivrance conjointe : Université Toulouse 3 Paul Sabatier (1969-2024)
• Jury : Président / Présidente : Alexis Valentin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Houzé, Jérôme Clain, Christian Doerig
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Pradines

Mots clés

Mots clés contrôlés

Diagnostic biologique

Artémisinine

Paludisme

Mots clés libres

Paludisme

Résistance

Artémisinines

Plasmodium falciparum

Sélection in vitro

Malaria

Resistance

Artemisinins

Plasmodium falciparum

In vitro selection

Résumé

En 2022, près de 250 millions de cas de paludisme responsables de plus de 600 000 décès ont été recensés dans le monde. Cette maladie infectieuse est causée par des parasites du genre Plasmodium. Plasmodium falciparum est l’espèce la plus mortelle et la plus répandue sur le continent africain, où plus de 90% des cas et des décès surviennent. La lutte contre le paludisme fait face à la résistance de P. falciparum aux artémisinines (ARTs), composant principal des thérapies combinées à base d’artémisinine, utilisées en traitement de première intention. A ce jour, les outils utilisés pour surveiller la propagation de la résistance aux ARTs sur le terrain sont i) une clairance parasitaire retardée chez les patients, ii) les mutations sur le gène Pfk13 qui confèrent la résistance et iii) des taux de survie élevés à l’issue d’une brève exposition in vitro de très jeunes parasites à un traitement aux ARTs dans le Ring-stage Survival Assay (RSA0-3h). Cependant, des cas de souches sans mutation du gène Pfk13 mais présentant des taux de survie élevés ou responsables de résistances cliniques compromettent le suivi de l’émergence de la résistance. Il est donc important de mieux comprendre le processus de sélection de la résistance aux ARTs afin de la contrôler efficacement. Dans ce contexte de résistance, il est également essentiel de développer de nouvelles molécules, actives sur les parasites résistants. La première partie de ce travail de thèse est consacrée à l’étude de la biologie du parasite P. falciparum soumis à la pression des ARTs. La résistance a été sélectionnée in vitro par trois ans de pressions médicamenteuses successives aux ARTs sur des isolats de terrain collectés en zones d’endémie (Afrique de l'Ouest, Asie du Sud-Est et Amérique du Sud). La caractérisation des souches ainsi sélectionnées a démontré que la pression des ARTs peut sélectionner in vitro des parasites présentant un phénotype résistant avec un « âge de résistance » inhabituel, ayant à la fois un taux de survie faible des très jeunes parasites en RSA0-3h et élevé lorsque les parasites traités sont plus âgés, et sans mutation sur le gène Pfk13. En revanche, sur l’ensemble des souches sélectionnées, 23 autres gènes sont mutés et constituent donc de potentiels nouveaux marqueurs moléculaires. De plus, il a été établi que ces souches pourraient supplanter leurs jumelles sensibles in vitro en l’absence de pression médicamenteuse et être transmises au moustique vecteur. Si de telles souches émergeaient sur le terrain, elles pourraient donc échapper à la surveillance des résistances et potentiellement se propager. Le phénotype de résistance mis en évidence a ensuite été étudié d’un point de vue biochimique, notamment par protéomique quantitative. Quatre candidats protéiques, potentiels marqueurs biochimiques du phénotype de résistance aux ARTs, ont pu être identifiés. Leur lien avec la capacité de résistance des parasites reste encore à valider. La deuxième partie du projet porte sur l’évaluation de l’activité de molécules à visée antipaludique dans un contexte de résistance aux ARTs. L’efficacité d’une association de molécules actuellement en développement clinique et de trois nouvelles séries chimiques a été évaluée. La combinaison KAF156-luméfantrine ainsi qu’une molécule hybride, l’emoquine-1, se sont révélées actives sur un panel de souches résistantes aux ARTs portant différentes mutations Pfk13. La mise en évidence de souches présentant des caractéristiques leur permettant d’échapper aux techniques de détection actuelles utilisées sur le terrain alerte sur l’importance d’améliorer la surveillance de la résistance aux ARTs et offre de nouvelles perspectives pour surveiller leur perte d'efficacité. Par ailleurs, les activités antipaludiques in vitro de KAF156-luméfantrine et de l’emoquine-1 sur les parasites résistants constituent un signe encourageant pour explorer la possibilité d’utiliser ces molécules comme partenaires des ARTs dans des thérapies combinées.

In 2022, there were almost 250 million cases of malaria worldwide, responsible for over 600,000 deaths. This infectious disease is caused by Plasmodium parasites. Plasmodium falciparum is the most lethal and widespread species on the African continent, where over 90% of cases and deaths occur. The fight against malaria faces the resistance of P. falciparum to artemisinins (ARTs), the main component of artemisinin-based combination therapies, used as first-line treatment. To date, the tools used to monitor the spread of ARTs resistance in the field are i) delayed parasite clearance in patients, ii) mutations in the Pfk13 gene that confer resistance, and iii) high survival rates following in vitro exposure of very young parasites to ARTs treatment in the Ring-stage Survival Assay (RSA0-3h). However, cases of strains without mutation in the Pfk13 gene but showing high survival rates or clinical resistance compromise the monitoring of resistance emergence. It is therefore important to better understand the selection process of ARTs resistance, in order to control it effectively. In this context of resistance, it is also essential to develop new molecules, active on resistant parasites. The first part of this thesis is dedicated to the study of the biology of the P. falciparum parasite under ARTs pressure. Resistance was selected in vitro by a three year-period of successive ARTs pressures on field isolates collected in endemic areas (West Africa, South-East Asia and South America). The characterization of the strains selected in this way demonstrated that ARTs pressure can select in vitro parasites with a resistant phenotype and an unusual ''age of resistance'', with both a low survival rate of very young parasites in the RSA0-3h and a high survival rate when the treated parasites are older, and without mutation in the Pfk13 gene. However, in the selected strains, 23 other genes in total were mutated, making them potential new molecular markers. Furthermore, it has been established that these strains could overtake their sensitive twins in vitro in the absence of drug pressure, and be transmitted to the mosquito vector. If such strains were to emerge in the field, they could therefore escape resistance monitoring and potentially spread. The resistance phenotype identified was then studied from a biochemical point of view, including quantitative proteomics. Four protein candidates have been identified as potential biochemical markers of the ARTs resistance phenotype. Their link with parasite resistance capacity remains to be validated. The second part of the project concerns the evaluation of the activity of antimalarial molecules in the context of ARTs resistance. The efficacy of a combination of molecules currently in clinical development and three new chemical series has been evaluated. The KAF156-lumefantrine combination and a hybrid molecule, emoquine-1, were shown to be active on a panel of ART-resistant strains carrying different Pfk13 mutations. The identification of strains with characteristics that would enable them to escape the current detection techniques used in the field highlights the importance of improving surveillance of ARTs resistance, and offers new insights for monitoring their loss of efficacy. Furthermore, the in vitro antimalarial activities of KAF156-lumefantrine and of emoquine-1 on resistant parasites is an encouraging sign for exploring the possibility of using these molecules as ARTs partners in combination therapies.