Recherche d'acteurs lysosomaux impliqués dans la présentation de lipides mycobactériens par CD1b aux lymphocytes T

Searching for lysosomal actors involved in mycobacterial lipids presentation by CD1b to T cells

• Auteur / Autrice : Sonia Belkai
• Direction : Martine Gilleron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et fonctionnelle
• Date : Soutenance le 19/11/2024
• Etablissement(s) : Université de Toulouse (2023-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie et de biologie structurale (Toulouse ; 1996-....)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de délivrance conjointe : Université Toulouse 3 Paul Sabatier (1969-2024)
• Jury : Président / Présidente : Rémy Poupot
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Oana Dumitrescu, Jean-Louis Herrmann, Ludovic Tailleux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glycolipides

Antigène CD1

Mycobacterium tuberculosis

Mots clés libres

Mycobacterium tuberculosis

Protéines CD1

Glycolipides

Lymphocyte T

Lysosome

Mycobacterium tuberculosis

CD1 proteins

Glycolipids

T lymphocytes

Lysosome

Résumé

Les lipides peuvent être antigéniques et présentés en surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Ces lipides, généralement amphiphiles, sont présentés par les protéines CD1 (CD1a à CD1d), des protéines proches structurellement de la protéine du CMH de classe 1, avec pour principale différence le site de liaison des antigènes. Cette présentation mène à une réponse immunitaire spécifique médiée par des lymphocytes T non conventionnels. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), agent causal de la tuberculose, possède dans son enveloppe des lipides antigènes présentés par les protéines CD1, et particulièrement par l'isoforme CD1b. Ces lipides sont chargés sur CD1b au niveau du lysosome des cellules dendritiques (CD), dans leur état natif ou après un apprêtement. Cet apprêtement nécessite des protéines de transfert de lipides (LTP), telles que CD1e et les saposines, mais aussi des enzymes (hydrolases), permettant de digérer les parties polaire ou apolaires des lipides. Peu de LTP et hydrolases lysosomales ont à l'heure actuelle été identifiées, il est donc nécessaire de caractériser d'autres acteurs lysosomaux impliqués dans la présentation des antigènes lipidiques mycobactériens par CD1b. Les objectifs de ces travaux étaient de mettre en place des stratégies pour rechercher et identifier ces acteurs. Ainsi, dans le but d'identifier de nouveaux acteurs lysosomaux impliqués dans le transport ou la maturation des glycolipides de Mtb, deux approches complémentaires ont été mises en place. La première, plus globale, nous a conduit à préparer des fractions enrichies en lysosomes provenant de CPA. Pour valider le protocole d'obtention de ces fractions, elles ont été caractérisées morphologiquement ainsi que par la présence de marqueurs protéiques. Elles ont également servi à réaliser des tests de dégradation de lipides mycobactériens in vitro, confirmant l'action des lipases précédemment caractérisées. Enfin, l'analyse protéomique du contenu de ces fractions a contribué à l'élaboration d'une liste de cinq protéines candidates, possiblement impliquées dans l'apprêtement. Parmi elles, certaines n'ont jamais été décrites dans le contexte de présentation de lipides antigènes, et d'autres sont déjà connues pour contribuer à la présentation de lipides par CD1d. La seconde approche a consisté à définir l'interactome de CD1b dans le lysosome, en réalisant une coimmunoprécipitation de CD1b à partir de fractions lysosomales. L'analyse protéomique des partenaires a permis de proposer quatre autres protéines candidates, toutes non décrites à ce jour dans le cadre de la présentation d'antigènes lipidiques. L'expression de certaines de ces protéines candidates, sera par la suite inactivée pour étudier l'impact de cette inactivation sur la présentation des complexes CD1b-lipides. Parmi ces protéines, la protéine NPC1 ('' Niemann-Pick disease C1 ''), déjà connue pour être impliquée dans la présentation de lipides par l'isoforme CD1d chez la souris, a retenu notre intérêt. Des essais d'inactivation ont été réalisés grâce à un inhibiteur spécifique, avant d'envisager une inactivation de l'expression par utilisation de siRNA ou CRISPR/Cas9. Dans le but d'apprécier les effets de cette inactivation, il est nécessaire de posséder des outils biologiques capables d'évaluer la participation du candidat dans la présentation d'un lipide particulier. Lors de cette étude, deux outils ont été validés : 1) des anticorps recombinants spécifiques de CD1 présentant le sulfoglycolipide diacylé mycobactérien (Ac2SGL), et 2) différents clones lymphocytaires spécifiques de CD1b en complexe avec divers glycolipides mycobactériens.

Lipids can be antigenic and presented on the surface of antigen-presenting cells (APCs). These lipids, generally amphiphilic, are presented by CD1 proteins (CD1a to CD1d), which are structurally similar to class I MHC proteins, with the main difference being in the antigen-binding site. This presentation leads to a specific immune response mediated by unconventional T lymphocytes. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis, has antigenic lipids in its envelope that are presented by CD1 proteins, particularly by the CD1b isoform. These lipids are loaded onto CD1b in the lysosome of dendritic cells (DCs), either in their native state or after processing. This processing requires lipid transfer proteins (LTPs), such as CD1e and saposins, as well as enzymes (hydrolases) that digest the polar or lipidic parts of the lipids. Few lysosomal LTPs and hydrolases have been identified so far, making it necessary to characterize other lysosomal actors involved in the presentation of mycobacterial lipid antigens by CD1b. The objectives of this work were to develop strategies to search for and identify these actors. To identify new lysosomal actors involved in the transport or maturation of Mtb glycolipids, two complementary approaches were implemented. The first, more global approach, involved preparing lysosome-enriched fractions from APCs. To validate the protocol for obtaining these fractions, they were characterized morphologically and by the presence of protein markers. They were also used to perform in vitro degradation tests of mycobacterial lipids, confirming the action of previously characterized lipases. Finally, proteomic analysis of the contents of these fractions led to the elaboration of a list of five candidate proteins that may be involved in processing. Among them, some have never been described in the context of lipid antigen presentation, while others are already known to contribute to lipid presentation by CD1d. The second approach involved defining the interactome of CD1b in the lysosome by performing co-immunoprecipitation of CD1b from lysosomal fractions. Proteomic analysis of the partners identified four other candidate proteins, none of which have been described to date in the context of lipid antigen presentation. The expression of some of these candidate proteins will subsequently be knocked out to study the impact of this inactivation on the presentation of CD1b-lipid complexes. Among these proteins, NPC1 (''Niemann-Pick disease C1''), already known to be involved in lipid presentation by the CD1d isoform in mice, was considered interesting. Inactivation tests were performed using a specific inhibitor, before considering inactivation of expression using siRNA or CRISPR/Cas9. To evaluate the effects of this inactivation, it is necessary to have biological tools capable of assessing the candidate's role in the presentation of a particular lipid. In this study, two tools were validated: 1) recombinant antibodies specific to CD1 presenting the mycobacterial diacylated sulfoglycolipid (Ac2SGL), and 2) different lymphocyte clones specific to CD1b in complex with various mycobacterial glycolipids.