Caractérisation des vésicules extracellulaires et étude de leur rôle dans la neuropathologie de la mucopolysaccharidose de type III

Characterization of extracellular vesicles and study of their role in the mucopolysaccharidosis type III neuropathology

• Auteur / Autrice : Chloé Dias
• Direction : Jérôme Ausseil, Stéphanie Trudel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 19/06/2024
• Etablissement(s) : Université de Toulouse (2023-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Toulousain des Maladies Infectieuses et Inflammatoires (Toulouse ; 2021-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cécile Malnou, Kumaran Deiva
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hélène Hirbec, Sylvain Lehmann, Christophe Lefebvre

Mots clés

Mots clés contrôlés

Héparane sulfate

Vésicules extracellulaires

Maladie de Hurler

Mots clés libres

Mucopolysaccharidose

Vésicules extracellulaires

Neurodégénérescence

Microglie

Héparane sulfate

Neuroinflammation

Mucopolysaccharidosis

Extracellular vesicles

Neurodegeneration

Microglia

Heparan sulfate

Neuroinflammation

Résumé

La mucopolysaccharidose de type III (MPS III) ou syndrome de Sanfilippo est une maladie pédiatrique rare, d'origine génétique, dite de surcharge lysosomale (MSL) et causée par le déficit en enzymes impliquées dans la dégradation de l'héparane sulfate. Le diagnostic tardif et l'absence de traitement curatif entrainent le décès de l'enfant avant l'âge adulte. Cependant les derniers essais cliniques de thérapie génique chez des enfants atteints de MPS III de type B ont donné des résultats prometteurs. L'accumulation progressive d'oligosaccharides d'héparane sulfate (HSOs) anormaux et partiellement dégradés dans le milieu extracellulaire, active directement la production de cytokines pro-inflammatoires par les astrocytes et la microglie. La mise en place précoce d'une neuroinflammation chronique conduit progressivement à la mort neuronale, à l'origine de troubles neurodégénératifs sévères et irréversibles. Les mécanismes cellulaires liés à la propagation de la neuroinflammation ne sont pas encore élucidés, et une des hypothèses est qu'elle pourrait être médiée par la sécrétion de vésicules extracellulaires (EVs). Chez l'adulte atteint de troubles neurodégénératifs, des travaux récents ont démontré que les EVs provenant de cellules activées et notamment de la microglie, sont chargées d'un contenu moléculaire pathologique spécifique et suscitent un vif intérêt lié à leur utilisation comme biomarqueurs. L'objectif de mon projet de thèse est d'investiguer la contribution des EVs dans la physiopathologie de la MPS III, par i) l'analyse de la composition en protéines et en ARNs des EVs-MPS III et ii) l'évaluation de la réponse biologique des neurones corticaux primaires naïfs au message transmis par ces EVs-MPS III. Dans ce but, j'ai isolé et étudié les EVs provenant de deux modèles de la maladie, le surnageant d'une lignée microgliale activée avec des HSOs de patients MPS III et les tissus cérébraux du modèle murin MPS IIIB. Par l'analyse de la composition en protéines et micro ARNs des EVs, j'ai pu mettre en évidence que les EVs-MPS III transmettent aux cellules réceptrices du système nerveux central (SNC) un cargo altéré et spécifique impliqué dans la réponse inflammatoire et dans le développement neuronal. Ensuite, grâce à des expériences de transmission des EVs-MPS III sur des neurones sauvages corticaux primaires, j'ai pu démontrer, par microscopie à fluorescence, que la morphologie des compartiments somato-dendritiques est fortement altérée. Ensuite, en utilisant des EVs isolés de cerveaux de souris MPS IIIB âgées de 1 mois, 4 mois et 8 mois, j'ai montré que les EVs induisaient une signature transcriptionnelle des neurones différente en fonction des stades de la maladie. En résumé, ces résultats suggèrent fortement que chez les patients atteints du syndrome de Sanfilippo, les EVs participent activement à la progression de la pathologie et au dysfonctionnement des neurones, certainement par la propagation de l'inflammation et l'altération des mécanismes de neurotransmission. Mon travail de thèse a permis de décrire dans nos modèles, que les EVs-MPS III transportent un contenu spécifique et caractéristique de la pathologie et de son évolution. Ces découvertes offrent la perspective d'utilisation des EVs comme biomarqueurs d'évaluation de l'efficacité thérapeutique pour les patients inclus dans les futurs essais cliniques.

Mucopolysaccharidosis type III (MPS III) or Sanfilippo syndrome is a rare pediatric inherited disease classified as a lysosomal storage disorder (LSD), caused by the deficiency of enzymes involved in the degradation of heparan sulfate (HS). Late diagnosis and lack of curative treatment lead to the death of the child before adulthood. However, the latest gene therapy clinical trial in children affected by MPS III type B have showed promising results. The progressive accumulation of abnormal and partially degraded heparan sulphate oligosaccharides (HSOs) in the extracellular space, directly activates the production of pro-inflammatory cytokines by astrocytes and microglia. The early onset of neuroinflammation leads progressively to neuronal death, causing severe and irreversible neurodegenerative deficiencies. The cellular mechanisms involved in the propagation of the neuroinflammation remains to be elucidated, and one hypothesis is that it could be mediated through the secretion of extracellular vesicles (EVs). In adults with neurodegenerative disorders, recent works demonstrated that EVs, derived from activated cells and in particular from microglia, are loaded with specific pathological molecular content and are arousing great interest for their use as biomarkers. The objective of my PhD is to investigate the contribution of EVs in the pathophysiology of MPS III, by i) analyzing the composition in proteins and RNAs of MPS III-EVs and ii) studying the biological response of naïve primary cortical neurons to the message transmitted by these MPS III-EVs. For this purpose, I isolated and studied EVs from two models of the disease, the supernatant of a microglia cell line activated by HSOs of MPS III patients and the brain tissues of the MPS IIIB mouse model. By analyzing the proteins and micro RNAs composition of EVs, I was able to demonstrate that MPS III-EVs transmit to the recipient cell of the central nervous system (CNS) a specific and altered cargo involved in inflammatory response and in neuronal development. Then, through transmission experiments of MPS III-EVs to wild-type primary cortical neurons, I was able to demonstrate by fluorescence microscopy, that the morphology of somato-dendritic compartment is strongly altered. Then, using MPS III-EVs isolated from MPS IIIB brains of mice aged of 1 month, 4 months and 8 months, I showed that EVs induced a different transcriptional signature of neuron depending on the stages of the disease. To summarize, these results strongly suggest that in patients with Sanfilippo syndrome, EVs actively participate to the neuron pathology and dysfunction, certainly through the spreading of inflammation and the alteration of neurotransmission mechanisms. My PhD work is the first report on the content of EVs released by MPS III microglia and reveals a disease-associated signature, providing a framework for future studies on biomarkers to evaluate efficiency of emerging therapies.