Mécanismes moléculaires contrôlant l’activité d’ADGRV1, une GPCR impliquée dans la surdité et la cécité

Molecular mechanism controlling the ADGRV1 activity, a GPCR protein involved in deafness and blindness.

• Auteur / Autrice : Yasmine Achat
• Direction : Nicolas Wolff, Bruno Collinet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 10/12/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Gènes, synapses et cognition
• Jury : Président / Présidente : Ali Ladram
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Rondard, Chiara Rapisarda
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Renaud Wagner, Chérine Bechara

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biologie moléculaire

Mutation (biologie)

Syndrome d'Usher

Récepteurs couplés aux protéines G

Mots clés libres

GPCR

Audition

Biologie structurale

GPCR

Hearing

Structural biology

Résumé

Les récepteurs couplés aux protéines G d'adhésion (aGPCR) jouent un rôle crucial dans de nombreuses fonctions biologiques de signalisation cellulaire. Parmi eux, ADGRV1 est essentiel dans les cellules sensorielles de l'audition et de la vision. Des mutations de cette protéine sont associées au syndrome d'Usher de type 2, une maladie génétique causant à la fois la surdité et la cécité chez l'Homme. En effet, dans les cellules ciliées, la grande région extracellulaire d'ADGRV1 compose des liens protéiques nécessaires au développement et au maintien de stéréocils mécanosensibles cruciaux pour l'audition. Dans les photorécepteurs, ADGRV1 est impliquée dans le transport de photopigments, nécessaires à la vision. Par ailleurs, la protéine a une activité de signalisation cellulaire démontrée dans des cellules modèles. Mon projet de thèse concerne l'activité GPCR et la structure d'ADGRV1, un récepteur orphelin, dont les mécanismes moléculaires de signalisation et de régulation sont inconnus. Dans cette étude, j'ai produit, purifié puis étudié les caractéristiques biophysiques d'ADGRV1β (47kDa) composé de sa partie GPCR et de son domaine intracellulaire, montrant sa pureté, sa stabilité et son état monomérique en micelle de détergent. Nous avons en parallèle produit des VHHs spécifiques du récepteur pour son étude structurale. Parmi ceux-ci, le VHH RE02 interagit avec ADGRV1β avec une forte affinité nanomolaire. La structure atomique du complexe ADGRV1β/RE02 a été résolue à une résolution de 3.8 Å par cryo-microscopie électronique (cryo-EM), décrivant l'état inactif du récepteur. L'analyse a montré l'absence de liaison de l'agoniste intramoléculaire des aGPCR appelé le peptide Stachel N-terminal, dans la poche orthostérique qui est maintenue compacte par des interactions hydrophobes essentiellement entre les segments transmembranaires. Une particularité de la structure inactive d'ADGRV1β est une longue boucle intracellulaire dont le repliement unique et stable encombre potentiellement le site de liaison aux protéines G. Afin de mieux comprendre l'activation d'ADGRV1β, un complexe GPCR/protéine Gi a été formé et étudié par cryo-EM. Son instabilité reflète une faible activation du récepteur. Ce résultat est cohérent avec nos études fonctionnelles en cellule qui montre une faible activité constitutive du récepteur passant par Gi, et qui est indépendante du peptide Stachel. Ces caractéristiques particulières d'ADGRV1, par rapport aux autres aGPCRs étudiés, peuvent être liées à son peptide Stachel non-consensus et à l'absence de résidu nécessaire à la transition conformationnelle du récepteur vers sa forme active. Enfin, des expériences de protéomique ont identifié la kinase GRK2, spécifique des GPCRs, comme un partenaire potentiel d'ADGRV1, ouvrant des perspectives sur l'activation d'autres voies de signalisation par le récepteur, notamment celle impliquant les arrestines.

Adhesion G protein-coupled receptors (aGPCRs) play a crucial role in many biological cells signaling functions. Among them, ADGRV1 is essential in the sensory cells of hearing and vision. Mutations in this protein are associated with Usher syndrome type 2, a genetic disease causing both deafness and blindness in humans. In hair cells, the large extracellular region of ADGRV1 forms the protein links required for the development and maintenance of mechanosensitive stereocilia that are crucial for hearing. In photoreceptors, ADGRV1 is involved in the transport of photopigments, which are essential for vision. The protein has also been shown to have signaling activity in model cells. My thesis project concerns the GPCR activity and structure of ADGRV1, an orphan receptor of which the molecular signaling and regulatory mechanisms are unknown.In this study, I produced, purified and then studied the biophysical characteristics of ADGRV1β (47kDa), composed of its GPCR part and its intracellular domain, showing its purity, stability and monomeric state in detergent micelles. In parallel, we produced receptor-specific VHHs for structural determination. Among these, the VHH RE02 interacts with ADGRV1β with a high nanomolar affinity. The atomic structure of the ADGRV1β/RE02 complex was resolved at 3.8 Å resolution by cryo-electron microscopy (cryo-EM), describing the inactive state of the receptor. The analysis showed the absence of binding of the intramolecular aGPCR agonist, the N-terminal Stachel peptide, in the orthosteric pocket, which is held compact by hydrophobic interactions mainly between the transmembrane segments. A particular feature of the inactive structure of ADGRV1β is a long intracellular loop whose unique and stable folding potentially obstructs the G protein binding site. To better understand the activation of ADGRV1β, a GPCR/Gi protein complex was formed and studied by cryo-EM. Its instability reflects low receptor activation. This result is consistent with our functional studies in cells, which show low constitutive activity of the receptor passing through Gi, and which is independent of the Stachel peptide. These particular characteristics of ADGRV1, compared with the other aGPCRs studied, may be related to its lack of consensus Stachel peptide and the absence of the residue required for the conformational transition of the receptor to its active form. Finally, proteomics experiments have identified the GPCR-specific kinase GRK2 as a potential partner for ADGRV1, raising the possibility that the receptor may activate other signaling pathways, particularly those involving arrestins.