La réplication du virus de l'hépatite B et son échappement à la réponse immunitaire sont favorisés par l'expression de l'ARNsp1, codant pour les protéines HBSP et HBc-Cys

Hepatitis B Virus replication and viral immune escape are supported by sp1RNA expression, encoding for HBSP and HBc-Cys

• Auteur / Autrice : Pierre Bablon
• Direction : Patrick Soussan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 20/11/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche Saint-Antoine (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Joëlle Sobczak
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Chemin, Camille Sureau, Jonathan Pol, Jérémy Augustin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hélène Strick-Marchand, Julie Lucifora

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus -- Reproduction (biologie)

Thérapeutique

Hépatite B

Épissage alternatif

Virus de l'hépatite B

Mots clés libres

Virus de l'Hépatite B

HBSP

Sphéroïdes

Épissage alternatif

HBc-Cys

Réponse immunitaire

Hepatitis B Virus

HBSP

Spheroids

Alternative splicing

HBc-Cys

Immune response

Résumé

L'infection par le Virus de l'Hépatite B (VHB) peut induire des dommages hépatiques tel que des hépatites fulminantes, une inflammation chronique du foie ou une cirrhose hépatique. Cependant, l'infection par le VHB in vitro est décrite comme silencieuse sur le métabolisme des cellules infectées. Cette discordance souligne l'importance de la réponse immunitaire dans la pathogenèse hépatique. L'épissage alternatif du VHB conduit à la formation de nombreux ARN épissés, dont le principal est l'ARNsp1. Celui-ci code notamment pour la protéine HBSP (Hepatitis B Splice-generated Protein) et pour une protéine de capside HBc-Cys, délétée de son dernier acide aminé. La progression de l'atteinte hépatique a été associée à une activation accrue de l'épissage du VHB. En outre, ces deux protéines virales sont impliquées soit dans le contrôle de la pathogenèse hépatique, soit dans la régulation du cycle viral. L'objectif de mes travaux de recherche a été de déterminer le rôle de l'ARNsp1 (et des protéines associées, HBSP et HBc-Cys) dans un contexte d'infection par le VHB dans un modèle 3D in vitro, et in vivo.Pour cela, des VHB recombinants sauvages (VHBwt) ou incapables d'exprimer l'ARNsp1 (VHBsp1mut) ont été utilisés pour infecter des hépatocytes primaires humains (PHH) cultivés en 2D et 3D, ainsi que des souris, grâce à des vecteurs AAV2/8 à tropisme hépatique.L'analyse transcriptomique des PHH 2D infectés par le VHBwt, comparés aux PHH non infectés (NI), a confirmé l'effet furtif de l'infection virale (seulement 16 gènes dérégulés (DEG) sur 13457). De façon surprenante, l'invalidation de l'ARNsp1 a augmenté le nombre de DEG à la fois dans le modèle 2D et le modèle 3D (jusqu'à 6 fois plus). Dans les PHH 3D, cette invalidation a révélé une seule voie de signalisation spécifiquement dérégulée, impliquée dans les interactions cytokines-récepteurs. Ces résultats ont conduit à l'exploration de l'impact de l'invalidation de l'ARNsp1 dans le foie de souris exprimant le VHB. L'analyse du transcriptome hépatique des souris transduites avec les AAV-VHBsp1mut a permis d'identifier trois voies spécifiquement dérégulées par l'invalidation de l'ARNsp1, avec une activation des voies du TNF-α, de l'IFNα et de l'IFNγ. Confortant ce résultat, cette activation a été associée avec un infiltrat immunitaire intrahépatique plus important. La trans-complémentation de l'AAV-VHBsp1mut dans des souris transgéniques exprimant HBSP (TgHBSP) a mis en évidence le rôle central de la protéine HBSP dans le contrôle de l'expression des gènes inductibles par l'interféron post-infection. Par contre, cette trans-complémentation n'a pas restauré l'expression de HBc, précédemment décrite comme étant réduite dans les souris exprimant le VHBsp1mut.En conclusion, nos résultats soulignent la contribution majeure de la protéine HBSP à l'effet furtif de l'infection par le VHB aussi bien in vitro que in vivo. De plus, HBc-Cys, également traduite à partir de l'ARNsp1, semble avoir un rôle pivot dans le cycle du VHB. Ainsi, la régulation de l'épissage alternatif du VHB apparaît comme un facteur clé dans la réplication virale et dans l'échappement immunitaire.

Hepatitis B Virus (HBV) infection is associated with liver damages, such as fulminant hepatitis, chronic liver inflammation or cirrhosis. In contrast, HBV infection in in vitro models remains stealthy, highlighting the main role of the host immune response during liver pathogenesis. Alternative splicing of the main viral transcript leads to the synthesis of sp1RNA, encoding for Hepatitis B Splice-generated Protein (HBSP) and a capsid protein HBc lacking its C-terminal amino-acid (HBc-Cys). Several studies have associated the progression of liver pathogenesis with an activation of HBV alternative splicing. In addition, these viral proteins were reported to be involved in the control of liver pathogenesis and in the regulation of HBV cycle. The aim of my study was to determine the role of sp1RNA (and its related proteins HBSP and HBc-Cys), expressed in infectious context, in both in vitro 3D model and in vivo.To this end, recombinant HBV particles containing either wildtype genome (HBVwt) or invalidated for sp1RNA expression (HBVsp1mut) were used for primary human hepatocytes (PHH) infection, in 2D and 3D models. In mice, these genomes were transduced using hepatotropic AAV2/8 vectors.Transcriptomic analysis of HBVwt-infected 2D PHH, compared with non-infected, confirmed the stealthiness of HBV infection, with only 16 differentially expressed genes (DEGs) out of 13457 genes quantified. Surprisingly, sp1RNA invalidation drastically increased the amount of DEGs in both 2D and 3D models (up to 6-fold). In 3D PHH, HBVsp1mut infection specifically deregulated genes involved in cytokines-receptors interactions. These results led us to explore the impact of sp1RNA invalidation on the liver of mice expressing HBV. Transcriptomic analysis of AAV-HBVsp1mut-transduced mice identified three gene sets specifically deregulated by sp1RNA invalidation (TNF-α, IFNα, IFNγ responses). Confirming this result, this activation was associated with a higher intra-hepatic immune infiltrate. Trans-complementation of HBVsp1mut in transduced transgenic mice expressing HBSP (TgHBSP) underlined the key role of HBSP in the control of interferon-stimulated genes expression. In contrary, this trans-complementation did not restore HBc expression, previously reported to be downregulated in HBVsp1mut-expressing mice.In conclusion, our results highlighted the major contribution of the sp1RNA-encoded protein HBSP to the stealthy effect of HBV infection, in vitro and in vivo. Additionally, HBc-Cys, also translated from sp1RNA, seemed to be critical to the regulation of viral cycle. Altogether, HBV alternative splicing may appear as a key factor for viral replication and immune escape.