Propagation et toxicité de la superoxide dismutase 1 dans la Sclérose Latérale Amyotrophique modélisée par des neurones moteurs dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Propagation and toxicity of superoxide dismutase 1 in amyotrophic lateral sclerosis

• Auteur / Autrice : Coline Jost Mousseau
• Direction : Delphine Bohl
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 11/10/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut du cerveau (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Hélène Blasco
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvain Lehmann
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Caroline Rouaux, Anselme Perrier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Maladies neurodégénératives

Cellules souches pluripotentes induites

Superoxyde dismutase

Neurones moteurs

Sclérose latérale amyotrophique

Mots clés libres

Motoneurons

Voie sécretion MAPS

SOD1 mal repliées

SLA

IPSC

Motor neurons

MAPS pathway

Misfolded SOD1

ALS

IPSC

Résumé

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative rapidement fatale et sans traitement curatif, qui entraîne la mort des neurones moteurs (MN) via des mécanismes encore mal identifiés. La dégénérescence des MN provoque une paralysie progressive, qui débute localement avant d'atteindre l'ensemble des muscles squelettiques. La progression de la paralysie ne semble pas suivre un schéma aléatoire, mais se propage en suivant le tractus nerveux. On peut donc faire l'hypothèse que la mort des MN pourrait impliquer la propagation de déterminants pathologiques toxiques. Parmi les nombreux gènes causaux de la SLA, il a été montré que plusieurs d'entre eux codent pour des protéines ayant un domaine ou des propriétés prion-like. C'est le cas du gène codant pour la superoxyde dismutase 1 (SOD1), qui est la deuxième cause génétique de SLA. Il a été montré que des mutations de SOD1 engendraient la formation de protéines mal repliées (misSOD1), capables de transmettre leur mauvaise conformation à d'autres protéines SOD1. Cependant, à ce jour, il n'existe aucune étude sur la sécrétion de SOD1 et misSOD1 dans des MN humains et dans un contexte proche des conditions physiologiques des patients. Ainsi, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d'étudier l'expression et la sécrétion des protéines SOD1 dans des MN dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de sujets contrôles et de patients mutés SOD1, et d'analyser les voies possibles de la sécrétion de ces protéines. Dans un premier temps, j'ai différencié des iPSC en MN spinaux et j'ai montré que misSOD1 s'accumulait dans les MN mutants. J'ai ensuite montré que SOD1 était sécrétée à la fois par des MN contrôles et des MN mutés, mais la voie classique médiée par le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi ne semblait pas impliquée. J'ai aussi observé que les MN sécrétaient des exosomes mais que ceux-ci ne contenaient apparemment pas SOD1. Dans un second temps, je me suis intéressée à une voie de sécrétion non conventionnelle spécifique aux protéines mal repliées : la voie MAPS (Misfolded-Associated Protein Secretion), majoritairement étudiée dans la sécrétion de l'α-synucléine. Cette voie est initiée par la deubiquitinase USP19 qui redirige les protéines mal repliées destinées à une dégradation protéasome par déubiquitination. La protéine chaperonne DNAJC5 forme ensuite des cargos avec les protéines déubiquitinées, qui sont alors dirigés par l'intermédiaire de différents organites, vers la membrane pour être sécrétés. J'ai montré que misSOD1 colocalisait avec DNAJC5 dans les MN SOD1 mutés, suggérant un rôle de la voie MAPS dans la sécrétion de SOD1. Pour confirmer cela, des vecteurs lentiviraux ont été produits pour transduire les MN et moduler l'expression de USP19. La surexpression de USP19 n'a pas affecté les colocalisations misSOD1-DNAJC5, tandis que sa diminution a réduit le nombre de colocalisations. En réalisant une analyse transcriptomique sur les MN transduits, j'ai observé que seulement 30 gènes étaient dérégulés lors de la surexpression de USP19. Cependant, en diminuant USP19, plus de 3000 gènes étaient dérégulés et sept voies étaient significativement dérégulées dont la voie de sécrétion protéique, suggérant l'importance de USP19 dans cette voie. Les perspectives de cette étude incluent d'explorer la propagation de la misSOD1 dans des cocultures entre des MN contrôles et mutants, pour investiguer l'importance de USP19 et de la voie MAPS dans la propagation. En conclusion, mes travaux ont montré que SOD1 était sécrétée par des MN de patients mutés SOD1 et que la voie MAPS pourrait être impliquée pour que les MN en souffrance se débarrassent des protéines mal repliées. Pouvoir moduler la sécrétion de SOD1 pourrait représenter une cible thérapeutique prometteuse pour ralentir la progression de la SLA, mais un équilibre devra être trouvé pour permettre de limiter à la fois la toxicité intracellulaire et la propagation des protéines toxiques.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a rapidly fatal neurodegenerative disease with no curative treatment, leading to the death of motor neurons (MN) through mechanisms that are still poorly understood. The degeneration of MN causes progressive paralysis, which begins focally before affecting all skeletal muscles. The progression of paralysis does not follow a random pattern but spreads along the nerve tract. Therefore, it can be hypothesized that the death of MN could involve the propagation of toxic pathological determinants from one cell to another.Among the many causal genes of ALS, several have been shown to code for proteins with a prion-like domain or properties. This is the case for the gene coding for superoxide dismutase 1 (SOD1), which is the second most common genetic cause of ALS. It has been demonstrated that mutations in SOD1 result in misfolded proteins (misSOD1) capable of transmitting their misfolded conformation to other SOD1 proteins. However, to date, there are no studies on the secretion of SOD1 and misSOD1 in MN under conditions close to the physiological context of patients. Therefore, the aim of my thesis work was to study the expression and secretion of SOD1 and misSOD1 in MN derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) from control subjects and SOD1-mutated patients and to analyze the possible pathways of these proteins' secretion. First, I differentiated iPSCs into spinal MN and showed that misSOD1 accumulated in mutant MN. I then showed that SOD1 was secreted by both control and mutant MN, but the classical pathway mediated by the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus did not seem to be involved. I also observed that MN secreted exosomes, but they apparently did not contain SOD1. In the second phase, I focused on an unconventional secretion pathway specific to misfolded proteins: the MAPS pathway (Misfolded-Associated Protein Secretion), which has mainly been studied in the context of α-synuclein secretion. This pathway is initiated by the deubiquitinase USP19, which redirects misfolded proteins destined for proteasomal degradation by deubiquitination. The chaperone protein DNAJC5 then forms cargos with the deubiquitinated proteins, which are progressively directed via different organelles to the membrane for secretion. I showed that misSOD1 colocalized with the DNAJC5 protein in SOD1 mutant MN, suggesting a role for the MAPS pathway in SOD1 secretion. To confirm this, lentiviral vectors were produced to transduce the MN and modulate USP19 expression. Overexpression of USP19 did not change the number of colocalizations between misSOD1 and DNAJC5; however, decreasing USP19 reduced these colocalizations, suggesting the involvement of the MAPS pathway in misSOD1 secretion. By performing RNA sequencing on transduced MN, I observed that only 30 genes were deregulated with USP19 overexpression. However, with USP19 downregulation, 1758 and 1410 genes were respectively upregulated and downregulated. Seven pathways were significantly deregulated, including the protein secretion pathway, suggesting the importance of USP19 in protein secretion. The perspectives of this study include exploring the propagation of misSOD1 in cocultures between control and mutant MN to investigate the importance of USP19 and the MAPS pathway in propagation. In conclusion, my work has shown that SOD1 is secreted by MN from SOD1-mutated patients and that traditional secretion pathways are not involved, in contrast to the MAPS pathway. Therefore, the ability to modulate SOD1 secretion could represent a promising therapeutic target for slowing the progression of ALS.