Induction de la tolérance néonatale médiée par les récepteurs Fc au facteur VIII thérapeutique dans l'hémophilie A

Induction of neonatal Fc receptor-mediated tolerance to therapeutic factor VIII in Hemophilia A

• Auteur / Autrice : Alejandra Reyes Ruiz
• Direction : Sébastien Lacroix-Desmazes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 17/10/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherche des Cordeliers (Paris ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphanie Graff-Dubois
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Christophe, Friederike Jönsson
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Valérie Gouilleux-Gruart, Sahil Adriouch

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tolérance immunitaire

Anticorps antifacteur VIII

Récepteurs Fc

Hémophilie A

Facteur antihémophilique A

Mots clés libres

Hémophilie A

Facteur VIII

Récepteur Fc néonatal

Hemophilia A

Factor VIII

Neonatal Fc receptor

Résumé

Le facteur de coagulation VIII (FVIII) joue un rôle crucial dans le contrôle des hémorragies. Les carences en FVIII conduisent au développement de l'hémophilie A. Bien que la thérapie de remplacement avec des produits dérivés du FVIII ait une efficacité sans précédent dans la gestion clinique de la maladie, la protéine possède une demi-vie courte et une immunogénicité supérieure à celle d'autres protéines thérapeutiques. La fusion du FVIII avec le fragment Fc de l'IgG1 a été exploitée pour prolonger la demi-vie de la protéine grâce à son recyclage par le récepteur Fc néonatal (FcRn). Cette extension est cependant inférieure à celle obtenue pour d'autres produits fusionnés au Fc et contraint les patients à des infusions bihebdomadaires. Le FcRn médie non seulement le recyclage mais aussi le transfert transplacentaire des molécules porteuses de Fc. En raison de la démonstration préalable qu'une tolérance partielle envers le FVIII peut être atteinte chez les descendants de souris FVIII-KO femelles traitées lors de la gestation avec les domaines A2 et C2 du FVIII fusionnés au Fc, l'hypothèse d'une induction complète de tolérance suite à une exposition in utero au FVIII entier a été soulevée. Cependant, les niveaux de rFVIIIFc traversant le placenta sont insuffisants pour établir une tolérance chez les descendants. Dans ce contexte, nous avons recherché les raisons des limitations thérapeutiques du FVIII et de son faible transfert transplacentaire, avec la proposition d'ouvrir un espace mutationnel pour réduire ses propriétés délétères.Les processus de recyclage et de transfert transplacentaire impliquent la liaison du fragment Fc au FcRn dans les endosomes acides et la dissociation du complexe lors de l'exposition au pH physiologique extracellulaire. En effectuant des analyses d'interaction en temps réel et des ELISAs, nous avons observé une liaison du rFVIIIFc au FcRn à pH acide mais aussi neutre, ce qui pourrait expliquer un recyclage médiocre et un faible transfert transplacentaire aux fœtus. Grâce à la modélisation moléculaire et à l'ingénierie des protéines, nous avons conclu que la liaison impliquait les domaines C1 et C2 du FVIII. Nous avons généré un mutant rFVIIIC1C2Fc qui présentait une liaison inférieure au FcRn à pH neutre. Le mutant a montré une demi-vie 2,5 fois plus longue que le rFVIIIFc chez les souris VWF-KO, et un transfert transplacentaire 8 fois plus élevée chez les souris FVIII-KO. En réalisant des microarrays de protéines et des dosages d'interactions protéine-protéine, nous avons découvert la promiscuité de liaison aux protéines du rFVIIIFc, ce qui pourrait expliquer, au moins en partie, à la fois son faible transfert transplacentaire et sa courte demi-vie. La promiscuité du FVIII était médiée par les domaines C1 et C2, et était masquée par le VWF. En effet, le rFVIIIFc était mieux endocytosé par les cellules endothéliales que notre mutant, ce qui conduisait à la dégradation intracellulaire d'un pourcentage significatif de la protéine. En parallèle, nous avons conçu deux molécules fusionnées au Fc contenant des peptides immunodominants de la protéine FVIII. Les deux molécules traversaient efficacement le placenta et réduisaient le développement d'anticorps spécifiques du FVIII chez les descendants de souris FVIII-KO injectées.En résumé, nous avons décrit les larges propriétés de liaison des protéines du rFVIIIFc. En raison de la dynamique du complexe FVIII-VWF, la promiscuité du rFVIIIFc libre peut expliquer sa courte demi-vie et le faible transfert transplacentaire, mais cela peut être amélioré par ingénierie des protéines. En particulier, le rFVIIIFc se lie au FcRn à pH neutre, ce qui peut nuire à son recyclage et à sa transcytose. Dans un tel scénario, le développement de molécules Fc contenant des peptides immunodominants de la protéine offre une solution pour l'établissement d'une tolérance partielle dès le début de la vie par transfert transplacentaire médiée par le FcRn.

Coagulation factor VIII (FVIII) plays a crucial role in the control of hemorrhages. Deficiencies of the protein lead to the development of a pathology named hemophilia A, in which the patients experience a bleeding tendency. While replacement therapy with FVIII-derived products has an unprecedent efficacy in the clinical management of the disease, the protein is endowed with a poor half-life and superior immunogenicity than other therapeutic proteins. The fusion of FVIII to the Fc fragment of IgG1 was previously exploited to extend its half-life from 12 to 18 hours through the recycling of the molecule by the neonatal Fc receptor (FcRn). The extension is yet inferior to the increase achieved by other Fc-fused products and ties the patients to twice weekly infusions of the molecule. FcRn not only mediate the recycling but also the transplacental delivery of Fc-porter molecules. As fetal development is endowed with a tolerogenic environment and due to the previous demonstration that partial tolerance towards FVIII can be achieved in the offspring of FVIII-KO mice treated with Fc fused A2 and C2 domains of FVIII; the idea of a complete tolerance induction following an in-utero exposure to the whole FVIII was raised. However, the levels of rFVIIIFc crossing the placenta are low and insufficient for a tolerance establishment in the offspring. In this context we aimed to investigate the reasons of FVIII therapeutic liabilities and low transplacental delivery, with the proposal of opening a mutational space to reduce its poor properties.The recycling and transplacental delivery processes imply the binding of the Fc fragment to the FcRn in acidic endosomes and the dissociation of the complex upon exposure to the extracellular physiological pH. By performing real time interaction analysis and enzyme-linked immunosorbent assays, we observed a binding of rFVIIIFc to FcRn at acidic but also neutral pH, which could account for a poor recycling and low delivery to the fetuses. Through molecular modeling and protein engineering, we concluded that the binding was mediated by the C1 and C2 domains of FVIII. We generated a rFVIIIC1C2Fc mutant that displayed a bona fide binding to FcRn at acidic pH yet lower binding at neutral pH. The mutant exhibited a 2.5-fold longer half-life than rFVIIIFc in mice deficient of its chaperone VWF, and 8-fold higher transplacental delivery in FVIII-KO-mice. When performing protein microarrays and protein-protein interaction assays we uncovered the promiscuous binding profile of rFVIIIFc, which could explain at least in part, both, low transplacental delivery and half-life. The promiscuous nature of FVIII was mediated by the C1 and C2 domains and shielded by VWF. Indeed, rFVIIIFc was better endocytosed by endothelial cells than our mutant, which lead to the intracellular degradation of a significant percentage of the protein. In parallel, we engineered two Fc fused molecules containing four or three immunodominant peptides of FVIII protein. The two molecules crossed the placenta efficiently and prevented the development of FVIII specific antibodies in the offspring of injected FVIII-KO mice.In summary, we described the broad protein binding properties of rFVIIIFc. Due to the dynamics of the FVIII-VWF complex, binding promiscuity of the free-rFVIIIFc can account for its short half-life and poor transplacental delivery, yet it can be ameliorated with protein engineering. In particular, rFVIIIFc binds to FcRn at neutral pH, which can impair both recycling and transcytosis. In such scenario, the development of Fc molecules containing immunodominant peptides or domains (A2 and C2) of the poorly transferred protein, offers a solution for the establishment of a partial tolerance early in life through the FcRn-mediated transplacental delivery of the molecules from mothers to their offspring in FVIII-KO mice.