Caractérisation biologique et biochimique de la dihydrouridilation de l'ARN ribosomique bactérien

Biological and biochemical characterization of dihydrouridilation in bacterial ribosomal RNA

• Auteur / Autrice : Sabrine Toubdji
• Direction : Damien Brégeon, Djemel Hamdane
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 18/09/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Adaptation biologique et vieillissement (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Laure Teysset
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Namy, Isabelle Iost
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Marc Graille, Jean-Jacques Diaz

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN -- Modifications posttranscriptionnelles

ARN ribosomiques

Enzymologie

Mots clés libres

Dihydrouridine

ARN

Dynamique

Enzyme

Modification Chimique

Dihydrouridine

RNA

Dynamic

Enzym

Chemical Modification

Résumé

La dihydrouridine (D) est une modification répandue et conservée au cours de l'évolution que l'on trouve principalement dans les ARNt et, dans une moindre mesure, dans les ARNm. Chez E. coli, elle s'étend jusqu'à la position 2449 de l'ARNr 23S, stratégiquement située près du centre peptidyltransférase du ribosome. Malgré l'existence de dihydrouridine synthases (DUS) connues, qui utilisent le NADPH et le FMN, l'enzyme responsable de la biosynthèse de D2449 est restée insaisissable.Cette étude présente une méthode rapide de détection de la D dans l'ARNr, impliquant le blocage de la transcriptase inverse sur le site D2449 marqué à la rhodamine, suivi d'une amplification par PCR (RhoRT-PCR). L'analyse de l'ARNr de diverses souches d'E. coli, y compris celles présentant des délétions chromosomiques et des mutations ponctuelles, a permis d'identifier le gène yhiN comme étant la dihydrouridine synthase ribosomique, désormais désignée sous le nom de RdsA.Les caractérisations biochimiques ont révélé que la RdsA était une nouvelle classe de flavoenzymes dépendant du FAD et du NADH et présentant une topologie structurelle complexe. Des essais in vitro ont montré que RdsA dihydrouridylait un transcrit d'ARNr, imitant un segment du centre peptidyltransférase, ce qui suggère une introduction précoce de cette modification avant l'assemblage du ribosome. Des études phylogénétiques ont révélé la distribution étendue du gène rdsA dans le règne bactérien, soulignant la conservation de la dihydrouridylation de l'ARNr.Ces résultats soulignent la préférence de la nature pour l'utilisation de la flavine réduite dans la réduction des uridines et de leurs dérivés, mettant en évidence l'importance de cette modification dans la biologie de l'ARN et la physiologie bactérienne, offrant de nouvelles voies pour explorer la signification biologique de la dihydrouridylation du CPT dans la fonction ribosomique.

Dihydrouridine (D) is a prevalent and evolutionarily conserved modification found mainly in tRNAs and, to a lesser extent, in mRNAs. In E. coli, it extends to position 2449 of the 23S rRNA, strategically located near the ribosome's peptidyl transferase site. Despite the existence of known dihydrouridine synthases (DUS), which utilize NADPH and FMN, the enzyme responsible for biosynthesizing D2449 has remained elusive.This study introduces a rapid method for detecting D in rRNA, involving reverse transcriptase blockage at the rhodamine-labeled D2449 site followed by PCR amplification (RhoRT-PCR). Through analysis of rRNA from diverse E. coli strains, including those with chromosomal deletions and point mutations, the yhiN gene was pinpointed as the ribosomal dihydrouridine synthase, now designated as RdsA.Biochemical characterizations revealed RdsA as a novel class of flavoenzymes dependent on FAD and NADH, exhibiting a complex structural topology. In vitro assays demonstrated that RdsA dihydrouridylates an rRNA transcript, mimicking a segment of the peptidyl transferase site, suggesting an early introduction of this modification before ribosome assembly. Phylogenetic studies unveiled the widespread distribution of the rdsA gene in the bacterial kingdom, emphasizing the conservation of rRNA dihydrouridylation.These findings underscore nature's preference for utilizing reduced flavin in the reduction of uridines and their derivatives, highlighting the importance of this modification in RNA biology and bacterial physiology, offering new paths for exploring the biological significance of PTC dihydrouridylation in ribosomal function.