L'optogénétique basée sur les opsines des vertébrés pour la restauration de la vision à haute sensibilité

Vertebrate opsin-based optogenetics for highly sensitive vision restoration

• Auteur / Autrice : Marco Rucli
• Direction : Deniz Dalkara
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Soutenance le 02/07/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la vision (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Filippo Del Bene
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ida Siveke, Maesoon Im

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dependovirus

Dégénérescence rétinienne

Thérapie génique

Optogénétique

Mots clés libres

AAV

Optogénétique

Rétine

Thérapie génique

AAV

Optogenetics

Retina

Gene therapy

Résumé

La thèse vise à développer une stratégie optogénétique de deuxième génération pour la restauration de la vision à l'aide de la thérapie génique. Cette approche est innovante dans son principe car elle est basée sur les opsines de vertébrés au lieu des opsines microbiennes largement utilisées. Le principal avantage des opsines de vertébrés est leur sensibilité beaucoup plus élevée, obtenue grâce à une cascade d'amplification du signal, qui leur permet de fonctionner dans des conditions d'éclairage ambiant ; des dispositifs d'amplification de la lumière ne devraient donc pas être nécessaires, comme c'est le cas pour les stratégies basées sur les opsines microbiennes publiées jusqu'à présent. De plus, étant donné leur origine mammifère, les opsines des vertébrés ne devraient pas déclencher de réponses immunologiques significatives lorsqu'elles sont surexprimées dans la rétine.Au cours de la thèse, il a été démontré qu'il est possible de cibler les opsines de vertébrés sur les neurones rétiniens internes restants dans une rétine dégénérée (cellules amacrines AII et cellules ganglionnaires de la rétine) d'un modèle de souris (rd1) pour la dégénérescence rétinienne. Dans les cellules amacrines AII, une des trois opsines testées, l'opsine Opn1sw, sensible aux courtes longueurs d'onde, a permis de restaurer partiellement la génération de signaux ex vivo lors d'une stimulation lumineuse ; ce résultat positif était cependant caractérisé par une faible efficacité, probablement due à une fuite du promoteur. En effet, le séquençage de l'ARN d'une seule cellule a montré une faible spécificité du promoteur et une fuite considérable vers d'autres types de cellules.Dans les cellules ganglionnaires rétiniennes, Opn1sw a entraîné une forte hyperpolarisation cellulaire lors de l'illumination lumineuse, un résultat inattendu compte tenu de la littérature disponible. En effet, les données publiées précédemment sur l'opsine sensible aux longueurs d'onde moyennes ont montré une forte dépolarisation cellulaire lors de la stimulation lumineuse (Berry et al., 2019).Lors d'un test comportemental in vivo, les opsines n'ont pas semblé déterminer un comportement induit par la lumière, ce qui suggère que des tests supplémentaires sont nécessaires pour évaluer pleinement leur potentiel dans la restauration de la vision.

The thesis aims at developing a second generation optogenetic strategy for vision restoration using gene therapy. This approach is innovative in principle because is based on vertebrate opsins instead of the widely used microbial opsins. The main advantage of vertebrate opsins is their much higher sensitivity, achieved through a signal amplifying cascade, which allows them to work under ambient lighting conditions; light-amplifying devices should therefore not be required, as is the case for microbial-opsin based strategies published to date. As an added benefit, given their mammalian origin, vertebrate opsins should not trigger significant immunological responses when overexpressed in the retina.During the thesis, it was shown that it is possible to target vertebrate opsins to remaining inner retinal neurons in a degenerated retina (AII amacrine cells and retinal ganglion cells) of a mouse model (rd1) for retinal degeneration. In AII amacrine cells, one out of the three tested opsins, the short-wavelength sensitive opsin Opn1sw, resulted in a partial restoration of ex-vivo signal generation upon light stimulation; such positive result was characterized, however, by a low efficiency, probably due to promoter's leakiness. Indeed, single cell RNA sequencing showed poor promoter's specificity and considerable leakiness towards other cells types.In retinal ganglion cells, Opn1sw resulted in strong cellular hyperpolarization upon light illumination, an unexpected result considering the available literature. Indeed, previously published data on the medium-wavelength-sensitive opsin showed strong cellular depolarization upon light stimulation (Berry et al., 2019).When tested in a behavioral test in vivo, opsins did not seem to determine a light-induced behavior, suggesting that further testing is needed in order to fully evaluate their potential in vision restoration.