Étude du développement et de l’architecture clonale des neurones pyramidaux du pallium de la souris grâce à des nouveaux outils multicouleurs de suivi du lignage et d’imagerie grand-volume

Study of the development and clonal architecture of murine pallial pyramidal neurons using new multiplexed lineage tracking and large volume imaging approaches

• Auteur / Autrice : Gabriel Kaddour
• Direction : Jean Livet, Emmanuel Beaurepaire, Gwenvaël Le Dréau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 16/07/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la vision (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Fiona Francis
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Spassky, Xavier Morin
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Michèle Studer, Frédéric Causeret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie électronique

Souris de laboratoire

Hippocampe (anatomie)

Physiologie

Néocortex

Développement neurologique

Réseaux neuronaux (physiologie)

Mots clés libres

Neurodéveloppement

Brainbow

Architecture clonale

Néocortex

Hippocampe

Souris

Neurodevelopment

Brainbow

Clonal architecture

Neocortex

Hippocampus

Mouse

Résumé

Dérivant du pallium embryonnaire, le néocortex et l'hippocampe du cortex cérébral des mammifères assurent les fonctions cognitives supérieures comme le raisonnement, le langage et la mémoire, grâce à l'activité des neurones pyramidaux. Ces neurones sont produits par les cellules souches corticales selon des étapes développementales globalement bien caractérisées, mais certains aspects fondamentaux restent encore flous, concernant notamment l'hypothèse formulée de longue date de l'existence d'unités radiales de neurones pyramidaux et celle de protomap corticale. Ce travail de doctorat a introduit et utilisé de nouvelles méthodes combinant marquage transgénique multicolore et imagerie grand volume à l'échelle subcellulaire pour affiner la caractérisation de l'architecture clonale des neurones pyramidaux corticaux durant le développement du pallium murin.Le premier chapitre de résultats présente et caractérise un nouveau modèle murin de type « Brainbow » dirigeant l'expression combinatoire de protéines fluorescentes dans les cellules souches corticales embryonnaires et leur descendance neuronale. Ce marquage identifie des ensembles de cellules souches adjacentes dans le neuroépithélium. L'imagerie multiphoton grand volume en blocs sériés (ChroMS) montre que les neurones pyramidaux dérivés de ces cellules souches se déploient tridimensionnellement sous forme de colonnes orientées radialement dans le néocortex et de bandes rostro-caudales dans l'hippocampe, lesquelles présentent localement une certaine mixité clonale. Dans le second chapitre nous avons analysé l'organisation clonale du pallium murin à partir du début de la corticogenèse. Un marquage épars a mis en évidence des divisions symétriques prolifératives dispersives prédominantes au début de la corticogenèse, évoluant au cours de la neurogenèse vers des divisions cohésives. Cette dynamique produit des clones de neurones pyramidaux fragmentés et dispersés sur de grandes distances, impliquant une mixité clonale dans le plan tangentiel confirmée par l'imagerie grand volume.Le troisième chapitre détaille le développement d'une nouvelle génération de transgènes Brainbow pour un suivi amélioré du lignage cellulaire et de la circuiterie neuronale. La conception de ces transgènes a été réalisée à partir d'un nouvel algorithme permettant la prédiction exacte du résultat de la recombinaison de séquences d'ADN arbitraires par le système Cre/lox. Ces transgènes permettent une expression Cre-dépendante, aléatoire et combinatoire de trois protéines fluorescentes spectralement distinctes, adressables à des compartiments subcellulaires spécifiques, avec un design compact facilitant leur intégration dans des vecteurs viraux. Pris ensemble, les résultats de cette thèse ont permis des avancées méthodologiques et fondamentales dans le domaine du neurodéveloppement. Ils révèlent notamment comment la prolifération des cellules souches corticales avant et pendant la genèse des neurones pyramidaux patterne l'architecture clonale du pallium. Ce travail pose ainsi le contexte biologique et méthodologique permettant d'investiguer le lien entre ontogenèse et fonction dans le pallium et de caractériser l'effet de mutations sur le développement cortical murin avec une précision accrue.

Derived from the embryonic pallium, the neocortex and hippocampus of the mammalian cerebral cortex are responsible for higher cognitive functions such as reasoning, language and memory, thanks to the activity of pyramidal neurons. These neurons are produced by cortical stem cells through globally well-characterized developmental steps. However, fundamental aspects of this process remain unclear, concerning in particular the long-standing hypothesis of the existence of radial units of pyramidal neurons and of a cortical protomap. This PhD work introduced and used new methods combining multicolor transgenic labelling and large volume imaging at subcellular resolution to refine the characterization of the clonal architecture of cortical pyramidal neurons during murine pallial development.The first chapter of results presents and characterizes a new ‘Brainbow' mouse model directing the combinatorial expression of spectrally distinct fluorescent proteins in embryonic cortical stem cells and their neuronal progeny. This labelling identifies sets of adjacent neural stem cells in the neuroepithelium. Large volume multiphoton imaging with serial tomography (ChroMS) shows that pyramidal neurons derived from these neural stem cells unfold three-dimensionally as radially oriented columns in the neocortex and rostro-caudal bands in the hippocampus, with some degree of local clonal mixing. In the second chapter of results, we analyzed the clonal organization of the murine pallium from the onset of corticogenesis. Sparse labelling revealed dispersive proliferative symmetrical divisions predominant at the start of corticogenesis, evolving during neurogenesis towards cohesive divisions. This dynamic produces clones of pyramidal neurons that are fragmented and dispersed over large distances, implying a clonal mixity in the tangential plane confirmed by large-volume imaging. The third chapter details the development of a new generation of Brainbow transgenes for improved monitoring of cell lineage and neuronal circuitry. The design of these transgenes was based on a new algorithm predicting the result of the recombination of arbitrary DNA sequences by the Cre/lox system. These transgenes drive Cre-dependent, random and combinatorial expression of three spectrally distinct fluorescent proteins, addressable to specific subcellular compartments, with a compact design facilitating their integration into viral vectors. Taken together, results from this thesis yield methodological and fundamental advances in the field of neurodevelopment. In particular, they reveal how the proliferation of cortical stem cells before and during the genesis of pyramidal neurons shapes the clonal architecture of the pallium. This work thus provides the biological and methodological context for investigating the link between ontogeny and function in the pallium and for precisely characterizing the impact of mutations on murine cortical development.