Développement de sondes chimiogénétiques fluorogéniques par ingénierie concertée de la protéine HaloTag et de rotors moléculaires : application à l'imagerie de protéines

Development of fluorogenic chemogenetic probes through concerted engineering of the HaloTag protein and molecular rotors : application to protein imaging

• Auteur / Autrice : Justine Coïs
• Direction : Jean-Maurice Mallet, Vincent Vialou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie moléculaire
• Date : Soutenance le 28/06/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie moléculaire de Paris centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des biomolécules (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Ludovic Jullien
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Coralie Fassier
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Claire Deo, Gilles Clavier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Exocytose

Imagerie médicale

Sondes fluorescentes

Protéines fluorescentes

Mots clés libres

Fluorescence

Chimiogénétique

HaloTag

Protéine

Sondes pH

Exocytose

Fluorescence

Chemogenetic

HaloTag

Protein

PH probes

Exocytosis

Résumé

Au cours des deux dernières décennies, notre compréhension sur les protéines du système nerveux et de leur rôle dans le fonctionnement normal et pathologique des maladies psychiatriques a considérablement progressé grâce aux avancées majeures des techniques d'imagerie et de ciblage des protéines. L'imagerie de fluorescence, une méthode non-invasive et très résolutive, permet de visualiser les protéines à l'échelle subcellulaire et étudier des mécanismes cellulaires fins en temps réel comme par exemple la sécrétion et la régulation du trafic de protéines. Ces études ont été initialement réalisées grâce au développement de protéines fluorescentes, bien que de brillance modérée et peu photostables. Plus récemment, le développement de senseurs chimiogénétiques hybrides, bénéficiant à la fois de la sélectivité de l'encodage génétique et de la versatilité des fluorophores organiques, a permis d'accroitre considérablement la diversité de rapporteurs fluorescents avec une brillance et une photostabilité accrues. La conception de nouveaux outils hybrides pour l'imagerie cellulaire est un enjeu afin d'obtenir des caractéristiques plus modulables, plus versatiles et permettre de répondre à la diversité des questionnements biologiques concernant le trafic de protéines cibles.Au cours de ma thèse, j'ai initialement développé des sondes fluorescentes chimiogénétiques novatrices basées sur la combinaison de la protéine de marquage HaloTag et de rotors moléculaires qui n'émettent de la fluorescence qu'après liaison covalente avec elle. Nous avons élaboré une nouvelle méthode de synthèse divergente pour diversifier plus rapidement les propriétés spectrales de ces sondes fluorogéniques hybrides. De plus, nous avons créé de nouveaux variants de HaloTag afin d'améliorer leurs brillances pour l'imagerie. Ces nouvelles sondes, testées en cellules vivantes, ont montré une sensibilité prometteuse envers la protéine HaloTag avec une activation spécifique de la fluorescence, ce qui a permis de réaliser de l'imagerie sans nécessiter d'étapes de lavage. Associés à une protéine d'intérêt, ces nouveaux rapporteurs fluorescents offrent un contrôle précis de la localisation subcellulaire et du suivi en temps réel, avec un très bon contraste.Dans la continuité de cette approche, j'ai développé des sondes pH reposant sur la combinaison de rotors moléculaires fluorescents contenant un groupement phénol sensible au pH et de la protéine HaloTag. Ces nouvelles sondes pH fluorogéniques hybrides bénéficient d'une double condition d'activation de la fluorescence reposant à la fois sur leur blocage conformationnel dans la poche de la protéine HaloTag et sur la déprotonation du groupement phénol à pH neutre. De ce fait, nous avons exploité cette activation locale de la fluorescence en fonction du pH afin de suivre des processus cellulaires dynamiques tels que la sécrétion de protéines en cellules vivantes sans recours au lavage et avec un excellent contraste.Dans la dernière étape de ma thèse, j'ai exploité ces nouveaux outils chimiogénétiques pour élucider le trafic de la protéine matricellulaire hevin. Cette protéine revêt un intérêt majeur pour la compréhension des maladies psychiatriques, en particulier l'addiction et les effets du stress, mais sa localisation subcellulaire et sa régulation demeurent peu clairs. Nous avons montré une colocalisation significative de hevin avec la protéine transmembranaire CD63, exprimée dans les exosomes. De plus, l'utilisation de la nouvelle sonde pH que j'ai développée a permis de confirmer la régulation de la sécrétion de hevin par l'activité cellulaire sur la lignée HeLa.

Over the past two decades, our understanding of nervous system proteins and their role in the normal and pathological functioning of psychiatric disorders has significantly advanced thanks to major breakthroughs in protein imaging and targeting techniques. Fluorescence imaging, a non-invasive, high-resolution method, enables proteins to be visualized at the sub-cellular level and fine cellular mechanisms to be studied in real time, such as secretion and the regulation of protein trafficking. These studies were initially made possible by the development of fluorescent proteins, albeit of moderate brightness and poor photostability. More recently, the development of hybrid chemogenetic sensors, benefiting from both the selectivity of genetic encoding and the versatility of organic fluorophores, has greatly increased the diversity of fluorescent reporters for real-time monitoring of cellular processes such as protein secretion and regulation of protein trafficking. However, the development of new hybrid imaging tools remains a current challenge in order to improve the quality of acquisitions (contrast, response time, cytotoxicity) and to obtain more versatile characteristics to address the variety of biological questions at hand.During my PhD, I initially focused on the development of new chemogenetic fluorescent probes based on the combination of the HaloTag labeling protein and molecular rotors emitting fluorescence only after covalent binding with it. We have developed a new divergent synthesis strategy allowing for a faster diversification of the spectral properties of these hybrid fluorogenic probes. Additionally, we have generated new variants of HaloTag to obtain higher brightness for fluorescence imaging. These new probes tested in living cells showed good sensitivity to the HaloTag protein with specific activation of fluorescence under wash-free conditions. Combined with a protein of interest, these new fluorescent reporters enable the control of subcellular localization with very good contrast.Continuing this approach, I developed pH-sensitive probes to explore the protein environment with additional contrast for visualizing dynamic processes such as protein secretion. We have shown that molecular rotors containing a pH-sensitive group allow for a dual fluorescence activation condition requiring both the presence of the HaloTag protein and a neutral pH. This property is very interesting as it combines local activation of fluorophores and pH detection in living cells, allowing for real-time monitoring of the exocytosis phenomenon of the protein of interest without washing and with excellent contrast.Finally, the final step of my PhD involved leveraging all of these newly generated chemogenetic tools to decipher the trafficking of the matricellular protein hevin. This protein is of major interest for understanding psychiatric disorders, particularly addiction and the consequences of stress, but its subcellular localization and regulatory process remain poorly understood. We have shown that this protein exhibits high colocalization with the transmembrane protein CD63 expressed in exosomes. Furthermore, the study of hevin exocytosis process with the newly developed pH probe confirmed the regulation of hevin secretion by cellular activity in the HeLa cell line.