Étude structurale et fonctionnelle de la fidélité des ADN polymérases X spécialisées dans la réparation des cassures doubles brins programmées chez Paramecium tetraurelia

Structure -Function study of DNA polymerases X involved in programmed DNA double strand break repair in Paramecium tetraurelia

• Auteur / Autrice : Antonin Nourisson
• Direction : Marc Delarue
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 15/04/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie Moléculaire Structurale et Processus Infectieux (Paris ; 2012-....)
• Jury : Président / Présidente : Catherine Vénien-Bryan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ghislaine Henneke
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mireille Bétermier, Bertrand Castaing

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réarrangement génétique

Cassures double-brin de l'ADN

Régénération (biologie)

ADN polymérases

Mots clés libres

Resection des extrémités non homologues

ADN Polymérases

Biologie Structurale

NHEJ

DNA Polymerases

Structural Biology

Résumé

L'eucaryote unicellulaire Paramecium tetraurelia est un organisme binucléé, qui a pour particularité de perdre lors de sa reproduction le noyau nécessaire à l'expression de ses gènes (somatique). Celui-ci doit donc être régénéré à partir de son autre noyau (germinal), quant à lui diploïde. Cette régénération passe par de nombreuses réplications du génome, mais surtout par des réarrangements massifs, dont certains consistent en l'introduction programmée de cassures double-brin à des milliers de sites dans le génome, afin d'éliminer des séquences d'insertion qui cassent le cadre de lecture dans de nombreux gènes. Une fois ces cassures introduites, elles sont réparées par un système qui repose sur des protéines impliquées dans la réparation non-homologue, ou NHEJ (Ku70/80, DNA-PKcs, Ligase IV, XRCC4) et sur 4 ADN polymérases. Cependant, il existe une différence majeure entre le NHEJ, qui est connu pour son fort taux d'erreurs, et le NHEJ chez la paramécie qui ne fait quasiment pas d'erreurs. L'objectif des travaux de cette thèse est d'expliquer la fidélité de ce système, en se focalisant sur les ADN polymérases impliquées dans cette réparation chez Paramecium tetraurelia.Dans un premier temps, une approche bio-informatique a été utilisée afin d'émettre des hypothèses sur les raisons de la fidélité de ces enzymes, en étudiant de façon approfondie la classification des ADN polymérases de la famille X. Après une étude enzymatique des ADN polymérases de Paramecium tetraurelia ayant permis de montrer leurs similitudes avec les ADN polymérases λ et β ainsi que leur grande fidélité, l'existence de deux mécanismes pouvant expliquer cette fidélité a été démontrée. Pour cela, l'activité enzymatique de mutants de l'ADN polymérase λ a été testée, et leur structure a été obtenue par cristallographie aux rayons X. Un premier mécanisme, similaire à celui rencontré chez l'ADN polymérase β, se base sur des changements conformationnels locaux au sein du site catalytique de l'enzyme. Le second mécanisme, jusqu'ici non caractérisé, utilise une boucle de 10 résidus pour stabiliser l'ADN au sein du site actif, uniquement en présence d'un nucléotide correct, et est retrouvé chez l'ADN polymérase λ. Ces nouvelles connaissances sur les bases moléculaires de la fidélité des ADN polymérases de la famille X apportent une meilleure compréhension de la fidélité du NHEJ de Paramecium tetraurelia, ce qui pourra permettre d'élargir les connaissances sur le NHEJ et ses implications dans le système immunitaire et dans la carcinogenèse.

The unicellular eukaryote Paramecium tetraurelia is a binucleate organism, which loses the nucleus required for gene expression (somatic) during reproduction. This nucleus must therefore be regenerated from its other nucleus (germinal), which is diploid. This regeneration involves numerous replications of the genome, but above all massive rearrangements, some of which consist in the programmed introduction of double-strand breaks at thousands of sites in the genome, in order to eliminate insertion sequences that break the reading frame in many genes. Once these breaks have been introduced, they are repaired by a system that relies on proteins involved in non-homologous repair, or NHEJ (Ku70/80, DNA-PKcs, Ligase IV, XRCC4) including 4 DNA polymerases. However, there is a major difference between classical NHEJ, which is known for its high error rate, and NHEJ in paramecium, which makes virtually no errors. The aim of this thesis is to explain the fidelity of this system, focusing on the DNA polymerases involved in this repair in Paramecium tetraurelia.Initially, a bioinformatics approach was used to hypothesize the reasons for the fidelity of these enzymes, by studying in depth the classification of DNA polymerases of family X. Following an enzymatic study of Paramecium tetraurelia DNA polymerases, which demonstrated their similarities to λ and β DNA polymerases, as well as their high fidelity, the existence of two mechanisms that could explain this fidelity was demonstrated. To this end, the enzymatic activity of DNA polymerase λ mutants was tested, and their structure obtained by X-ray crystallography. A first mechanism, similar to that encountered in DNA polymerase β, is based on local conformational changes within the enzyme's catalytic site. The second mechanism, uncharacterized until now, uses a 10-residue loop to stabilize the DNA within the active site, only in the presence of a correct nucleotide, and is found in DNA polymerase λ.These new insights into the molecular basis of X-family DNA polymerase fidelity provide a better understanding of Paramecium tetraurelia NHEJ fidelity, which may lead to a broader understanding of NHEJ and its implications in the immune system and carcinogenesis.