Identification d'anticorps spécifiques aux curares : Des patients allergiques jusqu'aux applications thérapeutiques

Antibodies against Neuromuscular Blocking agents in allergic patients : from mechanisms to therapeutics

• Auteur / Autrice : Alice Dejoux
• Direction : Pierre Bruhns, Aurélie Gouel-Chéron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 21/06/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physiologie, Physiopathologie et Thérapeutique (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Anticorps en Thérapie et Pathologie
• Jury : Président / Présidente : Nathalie Heuzé-Vourc'h
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Dan Longrois, Sophie Siberil
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sinisa Savic, Mauro Gaya

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bromure de rocuronium

Allergie -- Aspect Immunologique

Thérapeutique

Anticorps

Mots clés libres

Immunologie

Anticorps thérapeutiques

Curares

Rocuronium

IgG

Immunology

Therapeutic antibodies

Neuromuscular Blocking agents

Rocuronium

IgG

Résumé

Le rocuronium (roc) est un curare de 530Da utilisé lors des interventions chirurgicales afin de bloquer la jonction neuromusculaire des muscles striés squelettiques, facilitant ainsi l'intubation et la chirurgie. Les curares ont deux effets secondaires graves : l'hypersensibilité aiguë (1:10,000 procédures d'anesthésie) et la curarisation résiduelle persistante après la fin de l'intervention chirurgicale en l'absence de monitorage adapté. Le roc est un curare non dépolarisant largement utilisé, induisant un blocage neuromusculaire de durée intermédiaire et possédant l'incidence d'anaphylaxie la plus élevée. Les causes les plus plausibles d'anaphylaxie aux curares demeurent l'existence d'anticorps anti-curares chez les patients, impliquant des lymphocytes B spécifiques. Cependant, aucun anticorps spécifique anti-roc n'a été décrit et aucun outil biologique n'existe pour les détecter. Un seul médicament approuvé, le sugammadex, peut inverser le blocage neuromusculaire profond induit par le roc, mais ce médicament provoque aussi des effets secondaires allergiques. Ce travail a donc étudié les répertoires d'anticorps IgG des patients allergiques aux curares afin de comprendre leurs (poly)clonalité et d'identifier des anticorps susceptibles d'antagoniser le blocage neuromusculaire profond.Le roc étant une petite molécule non immunogène et chimiquement inerte, de nouveaux bioconjugués de roc ont d'abord été produits par couplage sur une protéine porteuse (phénomène d'hapténisation). Le répertoire d'anticorps des lymphocytes B mémoire de patients présentant une hypersensibilité suspectée au roc a ensuite été étudié à l'aide d'un système de culture cellulaire différenciant les lymphocytes B mémoire spécifiques en plasmocytes. Les anticorps ont été caractérisés par mesures d'affinité et de spécificité et, à l'aide d'outils bioinformatiques, les répertoires d'anticorps ont été analysés chez trois patients. Des anticorps spécifiques au roc provenant de souris immunisées ont également été générés par des méthodes distinctes: hybridomes et tri microfluidique. Les résultats montrent que les répertoires d'anticorps IgG anti-roc des patients allergiques sont polyclonaux, avec une grande diversité parmi les gènes V(D)J codant pour les régions variables sans preuve de groupes clonaux. Les anticorps se sont avérés posséder une affinité moyenne à faible, mais celui ayant la plus forte affinité a réussi à activer les mastocytes et à déclencher une anaphylaxie passive chez des souris transgéniques sous forme d'isotype IgE. Les anticorps isolés de souris immunisées étaient cependant d'une forte affinité et les répertoires oligoclonaux avec des familles V(D)J prédominantes. Exprimés sous forme d'IgE humains, les anticorps ont déclenché la dégranulation des mastocytes, des basophiles et ont induit une anaphylaxie systémique passive avec de très faibles doses d'anticorps et d'antigène. Leurs modes de fixation avec le roc ont été décryptés par cristallographie, permettant d'identifier l'ammonium quaternaire comme l'épitope allergènique potentiel. Un modèle prophylactique de prévention du blocage neuromusculaire a été établi chez la souris pour tester la capacité des anticorps à capturer le roc in vivo. L'anticorps avec la plus grande affinité pour le roc a réussi à inhiber le blocage neuromusculaire profond dans un modèle de primates avec un temps d'antagonisation compétitif avec le sugammadex. Nous rapportons pour la première fois les répertoires d'anticorps dirigés contre les curares provenant d'humains et décrivons les premiers anticorps monoclonaux anti-roc en termes de spécificité, d'affinité, de structure et d'efficacité thérapeutique. Ce travail devrait permettre d'élucider les causes sous-jacentes des réactions d'hypersensibilités aiguës aux curares, d'améliorer les outils de diagnostic et de valider une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour l'antagonisation du blocage neuromusculaire.

Rocuronium is a 530 Da Neuromuscular Blocking Agent (NMBA) used to paralyze skeletal muscles during surgery, hence facilitating surgery and permitting intubation. NMBAs have two severe side effects: rare cases of Acute Hypersensitivity Reactions (AHR) caused by anti-NMBA antibodies in patients (1:10,000 anesthesia procedures), and residual neuromuscular blockade after the end of surgery. Rocuronium is a widely used non-depolarizing NMBA, inducing among the longest residual neuromuscular blockade and the and highest anaphylaxis incidence. The most plausible causes of anaphylaxis to NMBA remain the existence of anti-NMBA antibodies in patients, implying NMBA-specific B cells. However, no anti-rocuronium specific antibodies have been described, and no biological tools are available. Only one approved drug, the cyclodextrin sugammadex, can reverse rocuronium-induced deep neuromuscular blockade but also causing allergic side effects. This work therefore investigated the IgG antibody repertoires of NMBA-allergic patients to understand their (poly)clonality and identify high-affinity antibodies that could reverse deep neuromuscular blockade.Since rocuronium is a non-immunogenic and chemically inert small molecule, novel rocuronium bioconjugates were first produced by haptenization on a carrier protein to perform downstream experiments. Then, the memory B cell antibody repertoire of patients with suspected hypersensitivity to rocuronium was investigated using a cell culture system differentiating rocuronium-specific memory B cells in antibody secreting cells. The rocuronium human-specific IgG antibodies were characterized by affinity and specificity measurements and using bioinformatic tools, the repertoires of B cell receptors were analyzed in three patients, including one sample with nine years interval. Rocuronium-specific antibodies from immunized mice were also generated with distinct methods: hybridoma technology and microfluidic sorting.The results show that the anti-rocuronium IgG antibody repertoires of AHR patients are polyclonal, with a high diversity among V(D)J genes coding for the antibodies variable regions without evidence of clonal groups. The human rocuronium-specific IgG antibodies had to medium- to low-affinity but the one with the highest affinity could activate human mast cell and trigger passive systemic anaphylaxis in transgenic mice, once switch in a human IgE antibody isotype. The antibodies isolated from immunized mice were, however, of high affinity and the IgG antibody repertoires were oligoclonal with identical predominant V(D)J families represented in the repertoire of distinct mice. Expressed as human IgE antibodies, the antibodies isolated from immunized mice triggered mast cell, basophil degranulation and induced passive systemic anaphylaxis in transgenic mice with very lose doses of antibody and antigen. Their binding modes with rocuronium was deciphered by X-ray crystallography, allowing the identification of the quaternary ammonium as the potential allergenic epitope. A model prophylactic model of prevention of neuro-muscular blockade was established in mice to test the ability of the antibodies to capture rocuronium in vivo. The antibody with the highest affinity for rocuronium could reverse rocuronium-induced deep neuromuscular blockade in non-human primates in vivo with a reversal time competitive with sugammadex.We report for the first-time antibody repertoires to NMBAs from humans and describes the first anti-rocuronium mAbs in terms of specificity, affinity, structure and therapeutic efficacy. This work should help to elucidate the underlying causes of AHR reactions to NMBAs, improve diagnostic tools following a NMBA-mediated allergy, and validate a novel potential therapeutic strategy for the reversal of neuromuscular blockade.