Microscopie optique avancée pour l'étude cérébrale précise spatialement et temporellement en profondeur

Advanced optical microscopy for spatially and temporally precise deep brain interrogation

• Auteur / Autrice : Cécile Telliez
• Direction : Valentina Emiliani
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 28/03/2024
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la vision (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Claire Wyart
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Paolo Medini, Maia Brunstein
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Chris Xu, Sophie Brasselet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Optogénétique

Holographie

Neurosciences

Photons

Microscopie

Mots clés libres

Microscopie

3 photons

Neuroscience

Holographie

Optogénétique

Microscopy

3 photon

Holography

Neuroscience

Optogenetics

Résumé

Dans le domaine des neurosciences, l'avènement des outils optogénétiques sensibles à la lumière a ouvert de nouvelles opportunités pour contrôler précisément l'activité neuronale et étudier le fonctionnement cérébral optiquement. En optique, cela a motivé le développement de diverses stratégies d'illumination et de collecte de la lumière pour imager l'activité neuronale et la manipuler avec une précision spatiotemporelle élevée. En particulier, les approches de mise en forme de la lumière, telles que l'holographie générée par ordinateur combinée à la focalisation temporelle, ont permis de cibler des neurones individuels ou des groupes de neurones avec une grande précision temporelle et une précision spatiale proche de la cellule unique, dans des espaces volumétriques de centaines de microns. Cette précision est cruciale pour obtenir des informations critiques sur le code neuronal et établir des connexions entre l'activité neuronale, le comportement et la perception à une échelle fine. Malgré ces avancées, des défis persistent pour permettre des investigations cérébrales complexes, notamment en ce qui concerne le contrôle de vastes populations de cellules avec une précision spatiotemporelle élevée en profondeur. Pendant ma thèse, j'ai particulièrement concentré mes efforts sur ces défis et développé de nouvelles stratégies optiques de mise en forme de la lumière visant à (i) étendre le nombre de neurones excitables, (ii) améliorer la résolution temporelle et (iii) augmenter la profondeur de pénétration de l'investigation optogénétique multi-photonique ciblée et basée sur la modulation de phase de la lumière.Initialement, j'ai concentré mes efforts sur le développement d'un système optique ultra-rapide à deux photons (2P) (FLiT), où un modulateur spatial de lumière et un miroir galvanométrique sont couplés pour permettre la commutation à un taux de kHz de motifs d'illumination précis spatialement sur l'échantillon. Cela sert deux objectifs principaux. Premièrement, cela permet d'ajuster optiquement le temps d'excitation relatif de cellules distinctes avec une résolution temporelle d'environ un ordre de grandeur supérieur par rapport aux méthodes précédentes. Deuxièmement, FLiT permet de cibler un ensemble donné de cellules en réduisant le budget de puissance d'excitation d'un facteur 4-5, tout en minimisant l'élévation thermique induite par la lumière. Pour pousser cette approche encore plus loin, j'ai ensuite modifié la conception optique originale en incluant une unité de de-scan (deFLiT), ce qui a permis d'élargir le nombre d'hologrammes utilisables et d'augmenter encore davantage le gain de puissance et la précision temporelle du FLiT conventionnel.Dans la deuxième phase de la thèse, je me suis concentré sur un système holographique à trois photons (3P) pour mener des expériences d'optogénétique plus profondément à l'intérieur du cerveau. J'ai conçu et construit le système, puis je l'ai validé en photo-activant diverses opsines et en induisant leur activation à haute fréquence dans les neurones ciblés sous un régime d'excitation à 3P que j'ai également vérifié. Par rapport aux systèmes holographiques à deux photons précédents, cette approche permettra d'étendre les investigations entièrement optiques à des régions plus profondes du cerveau.Ces nouvelles stratégies seront importantes pour étudier les circuits neuronaux avec une stimulation optogénétique rapide et précise à travers de vastes ensembles neuronaux en profondeur.

In the field of neuroscience, the advent of light-sensitive optogenetic tools has opened new opportunities for precisely controlling neuronal activity and study brain functioning optically. In optics, this has motivated the development of various light-delivery and collection strategies to functionally image and manipulate neural activity with high spatiotemporal precision. Particularly, light-shaping approaches, such as Computer-Generated Holography combined with Temporal Focusing, have enabled temporally precise targeting of individual neurons or clusters with near single-cell accuracy within volumetric spaces of hundreds of microns. This precision is crucial to get critical insights into the neural code and establishing connections between neural activity with behavior and perception at fine scale. Despite these advancements, challenges persist in enabling complex brain investigations, especially when it comes to control vast populations of cells with high spatiotemporal precision in depth. During my thesis, I particularly focused on those challenges and developed new light-shaping optical strategies aiming at (i) expanding the number of excitable neurons, (ii) improving temporal resolution and (iii) increasing the penetration depth of cell-targeted multiphoton optogenetic investigation based on phase-modulation light-targeting.Initially, I concentrated on developing an ultra-fast two-photon (2P) optical system (FLiT), where a multiplexing LC-SLM and a galvanometric mirror are coupled to allow kHz-rate switching of spatially precise illumination patterns on the sample. This serves two primary purposes. Firstly, it enables to optically tune the relative spiking time of distinct cells with a temporal resolution of about one order of magnitude higher compared to previous methods. Secondly, FLiT allows targeting a given ensemble of cells by reducing the excitation power budget by a 4-5 factor, while minimizing light-induced thermal rise. To push forward this approach, I further modified the original optical design by including a de-scan unit (deFLiT) which enabled to enlarge the number of usable holograms and increase even further the power gain and temporal precision of conventional FLiT .In the second phase of the thesis, I focused on a three-photon (3P) holographic system to conduct optogenetics experiments deeper inside the brain. I designed and built the system and I then validated it by photo-activating various opsins and driving high-rate firing in targeted neurons under a verified 3PE regime. Compared to previous holographic 2P-photon systems, this approach will enable the extension of all-optical investigations to deeper brain regions.These new strategies will be important for studying neuronal circuits with rapid and precise optogenetic stimulation across large neuronal ensembles in depth.