Identification des mécanismes cellulaires et moléculaires gouvernant la transformation maligne dans la Neurofibromatose de Type 1, en assurant la reproductibilité des analyses transcriptomiques

Deciphering cellular and molecular mechanisms driving malignant transformation in Neurofibromatosis Type 1 using a reproducible computational workflow for single-cell transcriptomics

• Auteur / Autrice : Audrey Onfroy
• Direction : Piotr Topilko, Denis Thieffry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 27/09/2024
• Etablissement(s) : Paris 12
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Créteil ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Mondor de Recherche Biomédicale (Créteil) - Institut Mondor de Recherche Biomédicale / IMRB
• Jury : Président / Présidente : Raphaël Margueron
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Piotr Topilko, Denis Thieffry, Eduard Serra Arenas, Loredana Martignetti, Sarah Cohen-Boulakia
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eduard Serra Arenas, Loredana Martignetti

Mots clés

Mots clés contrôlés

Neurofibromatose

Mots clés libres

Neurofibromatose de type 1

Tmgn

Transformation maligne

Transcriptomique à l'échelle cellulaire

Reproductibilité

Neurofibromatosis type 1

Mpnst

Malignant transformation

Single-Cell transcriptomic

Reproducibility

Résumé

La Neurofibromatose de Type 1 (NF1) est un syndrome causé par une haploinsuffisance du gène NF1 et affecte une naissance sur 3 000 dans le monde. Les patients sont prédisposés au développement de tumeurs des gaines nerveuses périphériques (PNSTs), issues de la lignée des cellules de Schwann ayant subi une perte de fonction de la seconde copie de NF1. Parmi les PNSTs, les neurofibromes plexiformes (pNFs) sont des tumeurs bénignes à croissance lente pouvant devenir défigurantes et douloureuses. Ces pNFs peuvent se transformer en PNSTs malins (MPNSTs) via un stade transitoire (neurofibrome dysplasique, dyNF). Les options thérapeutiques sont limitées en raison d'une faible caractérisation des mécanismes conduisant à cette progression tumorale.Notre laboratoire a développé un modèle murin qui reproduit fidèlement la pathogénie de divers types de neurofibromes, y compris la transformation maligne. Dans ce modèle, l'inactivation de la protéine NF1 est restreinte aux cellules des capsules frontières, un type spécifique de cellule gliale périphérique probablement à l'origine de ces tumeurs. Ce modèle offre une opportunité unique pour étudier l'initiation et la progression tumorale. Nous avons utilisé la technologie de séquençage d'ARN sur cellules uniques (scRNA-Seq) pour étudier l'hétérogénéité cellulaire de ces tumeurs. L'objectif biologique de ma thèse était d'analyser ces données afin de décoder les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant l'initiation et la progression maligne des tumeurs. L'objectif computationnel était d'assurer la reproductibilité des analyses, au niveau des publications scientifiques.Le traitement des données scRNA-Seq se compose de deux étapes principales, s'accentuant autour d'une matrice de comptage gènes-par-cellules. La première étape est reproductible et réutilisable au sein du laboratoire. A partir des matrices de comptage, un cadre informatique a été développé pour des analyses modulaires, reproductibles et lisibles.Nous avons généré un atlas transcriptomique unique des nerfs périphériques, révélant les mécanismes précoces conduisant à l'initiation des pNFs. Les nerfs précédant les pNFs sont plus épais (hyperplasiques) et caractérisés par une activité pro-fibrotique dans les cellules de Schwann tumorales, un profil pro-inflammatoire dans les fibroblastes endoneuriaux, et l'expansion d'une sous-population spécifique de macrophages endoneuriaux. Ce phénotype est accentué par l'haploinsuffisance de Nf1 et les traumas cutanés chroniques. Dans notre modèle murin, les MPNSTs se développent uniquement dans ce contexte de traumas, soulignant le rôle de l'inflammation dans la progression tumorale.Nous avons confirmé l'origine dyNF des MPNSTs par des expériences d'allogreffes. La transformation maligne se caractérise par la perte de marqueurs gliaux dans les cellules de Schwann tumorales et l'acquisition de caractéristiques mésenchymateuses. Des recherches supplémentaires ont démontré que notre modèle murin reproduit la perte génétique de Cdkn2a, l'événement génétique initial dans la progression tumorale chez les patients. Nous avons identifié le facteur de transcription SOX9 comme biomarqueur des MPNSTs. L'expression soutenue de SOX9 est associée à l'activité de la voie de signalisation Ras, la positionnant comme une cible thérapeutique potentielle dans les MPNSTs.En conclusion, notre travail présente le premier modèle qui récapitule la progression progressive des PNSTs, déclenchée par des traumas cutanés chroniques. Nous avons généré un atlas transcriptomique unique des premiers stades précédant la formation des pNFs et de la transformation maligne, sur deux fonds génétiques. Tandis que l'haploinsuffisance de Nf1 induit un phénotype plus sévère dans les nerfs hyperplasiques, elle n'affecte pas la composition des MPNSTs. Nos résultats offrent de nouvelles perspectives sur la pathogénie des PNSTs et guident le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Neurofibromatosis Type 1 (NF1) is a syndrome caused by NF1 haploinsufficiency and affecting 1 in 3,000 births worldwide. NF1 patients are predisposed for peripheral nerve sheath tumors (PNSTs) development, arising from the Schwann cell lineage that carry a genetic loss of function in the second Nf1 allele. Among PNSTs, plexiform neurofibromas (pNFs) are slow-growing benign tumors that can become disfiguring and painful. These pNFs can transform into malignant PNSTs (MPNSTs) via a transient dysplastic stage (dyNF). Limited therapeutic options persist due to a poor understanding of the mechanisms driving their initiation.Our laboratory has developed a mouse model that faithfully recapitulates the pathogenesis of diverse types neurofibromas, including the malignant transformation. In this model, NF1 protein inactivation is confined to boundary cap cells, a specific type of peripheral glial cell likely to be the origin of these tumors. This model offers a unique opportunity to study tumor initiation and progression. To explore the cellular heterogeneity and biological activity of these tumors, we employed the single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) technology. The biological aim of my thesis was to analyze these data to decode the cellular and molecular mechanisms governing tumor initiation and malignant progression. The computational aim was to ensure the reproducibility of the analyses, at the level of the scientific publications.The scRNA-Seq data processing consists of two main steps, joined by the genes-by-cells count matrix. The first step is reproducible and re-usable in the laboratory. From the count matrices, a computational framework was developed for modular, reproducible, and readable analyses.We generated a unique scRNA-Seq atlas of peripheral nerves, revealing the early mechanisms driving pNF initiation. Nerves preceding pNFs are thicker (hyperplastic) and characterized by pro-fibrotic activity in tumor Schwann cells, a pro-inflammatory profile in endoneurial fibroblasts, and the expansion of a specific subpopulation of endoneurial macrophages. This phenotype is triggered by Nf1 haploinsufficiency and chronic skin trauma.In our mouse model, MPNSTs developed only in the context of chronic skin trauma, highlighting the role of inflammation in tumor progression. We confirmed the dyNF origin of MPNSTs through allografting experiments. The malignant transformation is characterized by the loss of glial markers in tumor Schwann cells and the acquisition of mesenchymal features. Further research demonstrated that our mouse model replicates the genetic loss of Cdkn2a, the initial genetic event in tumor progression in NF1 patients. We identified the transcription factor SOX9 as a biomarker for MPNSTs. Sustained SOX9 expression is associated with Ras signaling pathway activity, positioning it as a potential therapeutic target in MPNSTs.In conclusion, our work presents the first model that recapitulates the stepwise progression of PNSTs, triggered by chronic skin trauma. We provided a comprehensive transcriptomic atlas of the early stages preceding pNF formation and the malignant transformation, on two genetic backgrounds. While Nf1 haploinsufficiency induced a more severe phenotype in hyperplastic nerves, it does not affect the composition of MPNSTs. Our findings offer new insights into the pathogenesis of PNSTs and guide the development of novel therapeutic strategies.