Approche génomique et épigénomique des néoplasies myélodysplasiques/myéloprolifératives avec mutation de sf3b1 et thrombocytose triple négatives

Genomic and epigenomic landscape of triple negative myelodysplastic/myeloproliferative neoplasia with SF3B1 mutation and thrombocytosis

• Auteur / Autrice : Marion Divoux
• Direction : Pierre Feugier, Julien Broséus
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 25/11/2024
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Nutrition - Génétique et Exposition aux Risques Environnementaux (Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Maud D’Aveni-Piney
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre Feugier, Éric Solary, Laurence Legros, Eric Lippert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Éric Solary, Laurence Legros

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules souches hématopoïétiques

Syndrome myélodysplasique

Tumeurs

Méthylome

Épigénétique

Mots clés libres

Mds/mpn-Sf3b1-T

Triple négatifs

Exome

Méthylome

Épigénétique

Mds/mpn-Sf3b1-T

Triple negative

Exome

Methylome

Epigenetic

Résumé

Les néoplasies myélodysplasiques, myéloprolifératives avec mutation de SF3B1 et thrombocytose sont des pathologies clonales de la cellule souche hématopoïétique regroupant des caractéristiques communes aux néoplasies myélodysplasiques (MDS) et aux néoplasies myéloprolifératives (MPN). La mutation JAK2V617F est retrouvée dans seulement 45 à 50% des cas. Les mutations de CALR ou MPL ne sont retrouvée que dans moins de 5% des cas. La prolifération plaquettaire est donc inexpliquée pour les 50% restant, conduisant à des difficultés diagnostiques pour ces MDS/MPN-SF3B1-T triple négatifs (MDS/MPN-SF3B1-T TN). Dans le but de comprendre le mécanisme moléculaire expliquant la thrombocytose, nous avons réalisé un séquençage complet d'exome et exploré la méthylation des MDS/MPN-SF3B1-T TN.Pour l'analyse d'exome, la cohorte de screening était constituée de 12 échantillons de 6 patients atteints de MDS/MPN-SF3B1-T TN : un échantillon cellulaire CD3+ (lymphocytes T, considérés comme tissu sain) et un échantillon CD3- (enrichi en granulocytes, considéré tumoral). L’analyse comparative a permis d’identifier 49 gènes candidats. Il a également mis en évidence un biais de transversion pouvant refléter une atteinte de la réparation BER et la duplication d'une région incluant le gène PTPN12. Le NGS ciblé des gènes candidats sur une cohorte de confirmation a identifié 5 gènes particulièrement pertinents : BRAT1, LMTK3, LTK, POU4F1, SGK223 et STAT5b. L'un des variants de STAT5B induit un épissage alternatif avec saut d'un exon aboutissant à une potentielle protéine tronquée non phosphorylable et pouvant être impliqué dans la prolifération hématopoïétique.Nous avons également développé ici une nouvelle approche d'analyse du méthylome à partir de données obtenues par RRBS comparatif sur une cohorte composée d'échantillons issus de 7 MDS/MPN-SF3B1-T JAK2V617F, 9 MDS/MPN-SF3B1-T TN, 8 MDS-SF3B1, 10 thrombocytémies essentielles JAK2V617F (TE JAK2V617F) et 4 moelles normales (MO). L'analyse du RRBS a été réalisée avec une nouvelle approche intégrant la position de chaque CpG dans les DMRs (Differentially methylated regions). Cette méthode a permis d'identifier 131 DMRs significativement hypométhylées et 103 DMRs significativement hyperméthylées dans les MDS/MPN-SF3B1-T TN par rapport aux MDS/MPN-SF3B1-T JAK2V617F. Nous avons établi un score clinique de pertinence pour sélectionner les DMRs en lien avec la thrombocytose non reliée à JAK2V617F, identifiant ainsi 15 DMRs annotées à 11 gènes.Neuf gènes candidats étaient reliés à la voie MAPK : 7 gènes hypométhylés dans les MDS/MPN-SF3B1-T TN par rapport aux MDS/MPN-SF3B1-T-JAK2V617F (AATK, BLCAP, DUSP2, FLT4, GPM6A, LHX6 et SPRY2) et 2 gènes hyperméthylés dans les MDS/MPN-SF3B1-T TN (LMX1B et IMPA2). Les transcrits de 8 de ces gènes ont été testés par qPCR dans des échantillons issus du RRBS. La qPCR a confirmé la surexpression de AATK, BLCAP, DUSP2, FLT4, LMX1B et SPRY2 dans les MDS/MPN-SF3B1-T TN par rapport aux MDS/MPN-SF3B1-T-JAK2V617F et par rapport aux MO. IMPA2 était sous-exprimé dans les MDS/MPN-SF3B1-T TN par rapport aux MDS/MPN-SF3B1-T-JAK2V617F et par rapport aux MO. GPM6A était était surexprimé dans les MDS/MPN-SF3B1-T TN et les MDS/MPN-SF3B1-T-JAK2V617F par rapport aux MO.En conclusion, nous avons identifié des candidats génomiques pertinents tels que STAT5B dont les analyses fonctionnelles doivent se poursuivre. Nous avons construit une méthode innovante d'analyse des données de RRBS pour l'identification et la sélection de DMRs potentiellement reliées à la thrombocytose indépendante de JAK2V617F dans les MDS/MPN-SF3B1-T-TN. Nous avons ainsi mis en évidence l'implication de la voie MAPK dans les MDS/MPN-SF3B1-T, en particulier TN. La régulation positive et négative des MAPKs dans les MDS/MPN-SF3B1-T ouvre la voie à de nouvelles thérapeutiques spécifiques et approches diagnostiques dans les MDS/MPN-SF3B1-T et plus généralement dans les MPN non mutés JAK2/CALR/MPL.

Myelodysplastic/myeloproliferative neoplasm with SF3B1 mutation and thrombocytosis (MDS/MPN-SF3B1-T) is a clonal hematopoietic stem cell disorder with overlapping features of myelodysplastic neoplasms (MDS) and myeloproliferative neoplasms (MPN). JAK2V617F mutations are found in only 45-50% of cases. CALR or MPL mutations are found in less than 5% of cases. Platelet’s proliferation remains then unexplained in the residual 50%, leading to diagnosis difficulties for these triple negative MDS/MPN-SF3B1-T (TN MDS/MPN-SF3B1-T). To understand the molecular mechanism underlying thrombocytosis, we explored whole exome sequencing and DNA methylation in TN MDS/MPN-SF3B1-T.Here, we developed a novel approach of DNA methylation profiling from the data obtained with comparative reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) on a cohort composed of 7 JAK2V617F MDS/MPN-SF3B1-T, 9 TN MDS/MPN-SF3B1-T, 8 myelodysplastic neoplasms with SF3B1 mutation (MDS-SF3B1), 10 JAK2V617F essential thrombocytemia (JAK2V617F TE) and 4 normal bone marrow (BM) samples. Comparative methylation analysis was initially performed by using R software package MethylKit and thereafter with a new designed approach integrating CpG position in differentially methylated regions (DMRs).This method identified 103 significant hypomethylated DMRs and 131 significant hypermethylated DMRs between JAK2V617F MDS/MPN-SF3B1-T and TN MDS/MPN-SF3B1-T. The filtering of significant DMRs relied on a clinical pertinence score, devised for selecting DMRs associated with JAK2V617F unrelated thrombocytosis. This approach enabled the identification of 15 significant DMRs associated with 11 genes overrepresenting the mitogen-activated protein kinases (MAPK) and related pathways.Nine candidate genes were particularly relevant and were related to MAPK pathway: 7 genes (AATK, BLCAP, DUSP2, FLT4, GPM6A, LHX6 and SPRY2) hypomethylated in MDS/MPN-SF3B1-T TN as compared to MDS/MPN-SF3B1-T-JAK2V617F and two genes (LMX1B and IMPA2) hypermethylated. The hypermethylation of LMX1B was reported to lead to upregulation of LMX1B messenger RNA in previous works. Corresponding transcripts were analyzed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) in RRBS samples. Consistently, qPCR confirmed overexpression of AATK, BLCAP, DUSP2, FLT4, LMX1B and SPRY2 transcripts in TN MDS/MPN-SF3B1-T as compared to JAK2V617F MDS/MPN-SF3B1-T, MDS-SF3B1 and normal BM. IMPA2 transcript was underexpressed in TN MDS/MPN-SF3B1-T as compared to JAK2V617F MDS/MPN-SF3B1-T, MDS-SF3B1 and normal BM. GPM6A transcript was overexpressed in TN MDS/MPN-SF3B1-T and JAK2V617F MDS/MPN-SF3B1-T compared to normal BM.In conclusion, we devised an innovative profiling method from RRBS measurements for selecting DMRs potentially associated with thrombocytosis but JAK2V617F-independent in TN MDS/MPN-SF3B1-T. We highlighted the implication of MAPK pathway in MDS/MPN-SF3B1-T and especially in TN MDS/MPN-SF3B1-T. The upregulation of MAPKs in MDS/MPN-SF3B1-T paves the way to specific therapeutic and diagnostic approaches in MDS/MPN-SF3B1-T and more generally in JAK2/CALR/MPL unmutated MPNs.