Développement d'une stratégie de CAR-T cells allogéniques : Lymphocytes T spécifiques anti-viraux aux molécules HLA classe I KO pour limiter la maladie du greffon contre l'hôte et le rejet de greffe

Improving Allogeneic CAR-T cells : HLA class I KO Virus Specific T cells to limit GvHD and graft rejection

• Auteur / Autrice : Valentine Wang
• Direction : Danièle Bensoussan-Lejzerowicz, Loïc Reppel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 17/12/2024
• Etablissement(s) : Université de Lorraine
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale BioSE - Biologie, Santé, Environnement
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Ingénierie Moléculaire, Cellulaire et Physiopathologie (Vandœuvre-lès-Nancy)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Caillat-Zucman
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Danièle Bensoussan-Lejzerowicz, Loïc Reppel, Stéphanie Nguyen Quoc, Cyrille Cohen, Gianpietro Dotti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Stéphanie Nguyen Quoc, Cyrille Cohen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rejet de greffe

Réaction du greffon contre l'hôte

Thérapeutique cellulaire

Récepteurs antigéniques chimériques

Mots clés libres

Thérapie CAR-T

Allogénique

Car-Vst

Maladie du greffon contre l'hôte

Délétion HLA

CAR-T therapy

Allogeneic

Car-Vst

Graft-Versus-Host-Disease

HLA knockout

Résumé

La thérapie CAR-T a transformé le traitement du cancer en modifiant les lymphocytes T pour cibler spécifiquement les antigènes tumoraux. Bien que cette approche ait montré un succès remarquable dans les hémopathies malignes à cellules B, le processus reste coûteux et long, car il nécessite la collecte et la modification des cellules du patient, ce qui peut retarder le traitement. De plus, certains patients, en raison de traitements antérieurs ou de maladies avancées, ne disposent pas de cellules viables, limitant l'accès à cette thérapie.Les cellules CAR-T allogéniques provenant de donneurs offrent une solution plus rapide et évolutive, réduisant le temps de production et les coûts. Cependant, elles présentent des risques, notamment la maladie du greffon contre l'hôte (GvHD), où les cellules du donneur attaquent les tissus du patient. Notre étude a exploré une approche innovante, combinant la technologie CAR avec des lymphocytes T spécifiques aux virus (Virus Specific T cells, VST), connus pour leurs propriétés antivirales et antitumorales, afin de générer des CAR-VST. Ces CAR-VST à double spécificité représentent une alternative prometteuse, particulièrement pour les patients à risque de rechute tumorale ou de réactivation virale.Dans notre étude, nous avons généré des CAR-T et des CAR-VST à partir des mêmes donneurs, obtenant respectivement 40,28%±9,30% et 35,96%±11,40% d'expression de CD19.CAR au jour 7 (N=3). Les CAR-VST ont montré in vitro une clairance tumorale similaire à celle des CAR-T, avec 74,13%±22,06% de lyse des cellules CD19+. Dans un modèle murin, un contrôle de la croissance tumorale ainsi qu'une amélioration de la survie similaires ont été observés dans les deux groupes. De plus, les CAR-VST ont conservé leur activité antivirale, lysant 62,32%±13,84% des cellules chargées en peptides viraux. Concernant l'alloréactivité, les CAR-VST ont montré une prolifération CD3+ inférieure (28,27%±21,64%) par rapport aux CAR-T (88,3%±24,48%, p=0,0285, N=4), suggérant un risque réduit de GvHD.En collaboration avec l'Université de Caroline du Nord, nous avons également exploré la suppression des molécules HLA de classe I via la B-2-microglobuline (B2M) pour réduire le risque de rejet immunitaire. Une expression de HLA-ABC de 15,1±14,6% (N=11) a été obtenue après knockout par CRISPR/Cas9. Nous travaillons également sur la surexpression de HLA-E et HLA-G pour prévenir la lyse médiée par les cellules NK, nécessitant des optimisations supplémentaires.En conclusion, générer des HLA-E+ ou G+/B2M-/CAR-VST offre une alternative prometteuse pour créer des cellules entièrement allogéniques. Ces CAR-VST modifiés conservent leurs fonctions antivirales et antitumorales, ce qui en fait des candidats prometteurs pour les immunothérapies prêtes à l'emploi qui pourraient réduire les risques de rejet immunitaire et de GvHD.

CAR-T cell therapy have revolutionized cancer treatment by modifying a patient's T cells to target specific tumor antigens. This personalized approach has shown remarkable success in treating B-cell malignancies like leukemia and lymphoma. However, the process is costly and time-consuming, as it involves collecting and modifying the patient's own cells, which delays treatment. Moreover, some patients may not have sufficient or viable T cells due to prior treatments or advanced disease stages, limiting the availability of CAR-T therapies for all patients.To address these challenges, allogeneic CAR-T cells from healthy donors provide a faster and more scalable solution, reducing production time and costs. However, these off-the-shelf therapies face risks like graft-versus-host disease (GvHD), where donor cells might attack the patient's tissues. Our study explored combining CAR technology with Virus Specific T cells (VSTs), known for their antiviral and antitumor properties, to generate CAR-VSTs. These dual-specific CAR-VSTs present a promising alternative, especially for patients prone to both tumor relapse and viral reactivation.In our study, we generated CAR-Ts and CAR-VSTs from same donors obtaining 40.28%±9.30% and 35.96%±11.40% CD19.CAR expression on day 7 (N=3), respectively. In vitro, CAR-VSTs showed robust tumor clearance similar to CAR-Ts, achieving 74.13%±22.06% lysis of CD19+ tumor cells. In a murine lymphoma model, both CAR-VSTs and CAR-Ts demonstrated comparable antitumor efficacy, successfully controlling tumor growth and improving survival. Moreover, CAR-VSTs maintained their antiviral function, efficiently lysing 62.32%±13.84% virus-peptide-pulsed cells, similar to native VSTs. We assessed the alloreactivity of CAR-VSTs and found that they exhibited significantly lower CD3 proliferation rates (28.27%±21.64%) compared to CAR-T cells (88.3%±24.48%, p=0.0285, N=4), indicating a reduced risk of GvHD. CAR-VSTs' dual-specificity for both tumor and viral antigens makes them a powerful tool to address cancer relapse and viral complications in patients.In collaboration with the University of North Carolina, we explored strategies to delete HLA class I molecules in CAR-VSTs by targeting B-2-microglobulin (B2M), aiming to reduce immune rejection. In addition, we worked on overexpressing tolerogenic molecules such as HLA-E and HLA-G to prevent NK cell-mediated lysis. Our results showed an HLA-ABC expression of 15.1±14.6% (N=11) after CRISPR/Cas9 knockout, which indicates successful deletion, though further optimization is necessary to prevent NK-lysis by re-expressing HLA-E or HLA-G.In conclusion, generating HLA-E+ or G+/B2M-/CAR-VSTs offers a promising alternative for creating fully allogeneic cells. These modified CAR-VSTs retain their dual antiviral and antitumor functions, making them a promising candidate for ''off-the-shelf'' immunotherapies that could reduce the risks of immune rejection and graft-versus-host disease.