Roles de NHSL3 dans la migration cellulaire

Roles of NHSL3 in cell migration

• Auteur / Autrice : Nikita Novikov
• Direction : Alexis Gautreau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 06/09/2024
• Etablissement(s) : Institut polytechnique de Paris
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de l'Institut polytechnique de Paris
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie Structurale de la Cellule (Palaiseau ; 1975-....) - Laboratoire de Biologie Structurale de la Cellule
• Jury : Président / Présidente : Nicolas David
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexis Gautreau, Thierry Dubois, Klaus-Peter Janssen, Christophe Le Clainche, Raphaël Guerois
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Thierry Dubois, Klaus-Peter Janssen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dynamique moléculaire

Protéines

Cellules -- Interaction

Mots clés libres

Actin

Migration cellulaire

Protéines NHS

Actin

Cell migration

NHS proteins

Résumé

Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la migration https://adum.fr/as/infosoutenances.pl?mat=142473#cellulaire restent partiellement compris, malgré de nombreuses avancées récentes. Ici, nous avons identifié NHSL3 comme un nouveau régulateur de la migration de cellules uniques et collectives. NHSL3 est un membre récemment identifié de la famille des protéines responsables du syndrome de Nance-Horan, dont le gène NHSL3, également connu sous le nom de KIAA1522, code pour quatre isoformes à travers différents sites d'initiation de la transcription et d'épissage alternatif dans les cellules mammaires humaines MCF10A. En utilisant des protéines de fusion GFP, nous avons montré que les trois isoformes longues étaient localisées à l’extrémité du lamellipode et aux contacts cellule-cellule, alors que l'isoforme courte n'était présente qu'à l’extrémité du lamellipode. Nous avons montré que le knock-out (KO) de NHSL3, qui inactivent toutes les isoformes dans les cellules MCF10A, altère la migration de cellules individuelles et de monocouches cellulaires collectives. Les monocouches KO présentent une diminution de la vitesse des cellules suiveuses qui ne suivent plus aussi efficacement que les sauvages les cellules pionnières dans un test de réparation de blessure. Quand les cellules KO sont isolées, elles migrent de manière plus persistante que les cellules parentales. Nous avons ensuite cherché à sauver le phénotype des cellules KO en exprimant les différentes isoformes de NHSL3. Toutes les isoformes ont plus ou moins sauvé le phénotype de migration collective, la plus efficace étant l'isoforme i2 et la moins efficace étant l'isoforme courte i3S. En revanche, et à notre grande surprise, seule l'isoforme courte i3S a sauvé la migration des cellules individuelles. De plus, un siRNA spécifique qui cible spécifiquement l'isoforme courte a montré le même phénotype de migration des cellules individuelles que le KO de NHSL3 qui inactive toutes les isoformes.Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués, nous avons recherché les partenaires des différentes isoformes par protéomique. Puis nous avons identifié des partenaires directs potentiels à l'aide d'un pipeline bioinformatique basé sur AlphaFold2 qui prédit les sites d’interaction putatifs. Les isoformes longues de NHSL3 interagissent avec des régulateurs bien connus du cytosquelette d'actine, tels que le complexe régulateur WAVE (WRC), IRSp53 et les protéines MENA/VASP. L'isoforme courte i3S interagit avec beaucoup moins de protéines, aucune d'entre elles n'étant un candidat évident pour contrôler la persistance de la migration des cellules individuelles. Dans les tests de migration collective, une forme mutante de i2 qui ne se lie pas aux protéines MENA/VASP empêche le recrutement des protéines MENA/VASP aux contacts cellule-cellule et ne sauve pas le phénotype de migration collective des cellules NHSL3 KO. Dans les tests sur cellules individuelles, une forme mutante de i3S dont l'interaction avec son partenaire 14-3-3θ est altérée ne recrute pas 14-3-3θ à l’extrémité du du lamellipode, et ne sauve pas le phénotype de migration de cellules individuelles. Pris ensemble, ces résultats démontrent que NHSL3 régule à la fois la migration des cellules uniques et collectives par des mécanismes différents qui impliquent des interactions spécifiques avec les protéines 14-3-3θ et MENA/VASP, respectivement.

The molecular mechanisms underlying cell migration remain incompletely understood, despite many recent advances. Here, we show that NHSL3, a recently identified member of the Nance-Horan Syndrome protein family, is a novel regulator of single cell and collective migration. The NHSL3 gene, also known as KIAA1522, encodes as many as four isoforms through different transcription initiation sites and alternative splicing in human breast MCF10A cells. Using GFP fusion proteins, we observed that all three long isoforms were localized at the lamellipodium edge and at cell-cell contacts, whereas the short isoform was only present at the lamellipodium edge. The NHSL3 knock-out (KO), inactivating all isoforms in MCF10A cells, impaired migration of single cells and collective monolayers. When wounded, KO monolayers display decreased speed of the cells that follow leader cells when compared with parental cells, whereas single KO cells were more persistent than parental cells. We then rescued KO cells with the different isoforms. All isoforms more or less rescued the collective migration phenotype, the most efficient being isoform i2 and the least efficient being the short isoform i3S. In sharp contrast and to our surprise, only the short isoform i3S rescued single cell migration. Moreover, a specific siRNA that targets specifically the short isoform displayed the same migration phenotype in single cells as the NHSL3 KO that inactivates all isoforms.To get an insight into the mechanisms involved, we performed comparative proteomics of the different isoforms and sorted potential direct partners by a bioinformatics pipeline based on AlphaFold2 that predicted putative binding sites. Long isoforms of NHSL3 interacted with well-known regulators of actin cytoskeleton, such as WAVE regulatory complex (WRC), IRSp53 and MENA/VASP proteins. The short i3S isoform interacted with much fewer proteins, none of which being an obvious candidate to control migration persistence of single cells. In collective migration assays, a mutant form of NHSL3 i2 that does not bind to MENA/VASP proteins impaired the recruitment of MENA/VASP proteins to cell-cell contacts and did not rescue the collective migration phenotype of NHSL3 KO cells. In single cell assays, a mutant form of NHSL3 i3S designed to impair the interaction with the 14-3-3θ partner failed to recruit 14-3-3θ at the lamellipodium edge and did not rescue the single cell migration. Altogether these results demonstrate that NHSL3 regulates both single cell and collective migration through different mechanisms that involve specific interactions with 14-3-3θ and MENA/VASP proteins, respectively.