Cristallographie résolue en temps du photorécepteur CarH

Time-resolved X-ray crystallography of the vitamin B12-dependent CarH photoreceptor

• Auteur / Autrice : Ronald Rios-Santacruz
• Direction : Martin Weik, Jacques Philippe Colletier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique pour les sciences du vivant
• Date : Soutenance le 26/09/2024
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique (Grenoble, Isère, France ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble, Isère, France ; 1992-....)
• Jury : Président / Présidente : Judith Peters
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Royant
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Robert, Thomas Barends

Mots clés

Mots clés contrôlés

Photorécepteurs (cellules)

Lumière -- Absorption

Caroténoïdes

Cyanocobalamine

Rayons X

Mots clés libres

Cristallographie sériel

X-Rays

Xfel

Adenosylcobalamine

Vitamine B12

CarH photoreceptor

Time-Resolved

Serial femtosecond crystallography

X-Rays

Adenosylcobalamine

Vitamin B12

CarH photoreceptor

Résumé

Les recherches effectuées durant cette thèse ont visé l’élucidation du mécanisme de photoactivation d’un photorécepteur fonctionnalisé par un dérivé de la vitamine B12 (adénosylcobalamine, AdoCbl) en utilisant une approche intégrative de dynamique structurale. Spécifiquement, nos travaux ont porté sur le photorécepteur CarH de la bacterie Thermus thermophilus (TtCBD), dont la fonction est de réguler l’expression de l’opéron CarB, codant pour un ensemble de gènes permettant la synthèse de caroténoides. Ces caroténoïdes participent à la lutte contre les dommages causés par les radiations lumineuses. Dans l’obscurité, le photorécepteur CarH est présent sous la forme d’un tétramère qui se lie au promoteur dudit opéron, empêchant ainsi la transcription de CarB. Sous l’effet de l’exposition à la lumière, ce tétramère se dissocie permettant ainsi la transcription de CarB. Nous nous sommes concentrés durant cette thèse sur le domaine de liaison à l’adénosylcobalamine, ce dernier récapitulant l’ensemble de la photophysique du récepteur entier, tout en permettant d’obtenir des cristaux diffractant à plus haute résolution.Afin de déterminer les changements structuraux photoinduits au sein de TtCBD en temps réel, nous avons utilisé la cristallographie aux rayons X, et plus particulièrement la cristallographie sérielle résolue en temps à l’échelle de la femtoseconde (ou time-resolved serial femtosecond crystallography, TR-SFX) comme principale méthode d’étude. Les recherches effectuées durant cette thèse ont permis de dépasser certains défis majeurs de cette technique, en refondant l’ensemble de la méthodologie, de la préparation des échantillons jusqu’à la collecte et le traitement des données. Notamment, nos travaux ont permis le développement de protocoles standardisés pour l'obtention de microcristaux de TtCBD et leur présentation au faisceau de rayons X par le biais de supports solides (ou fixed targets) ou de micro-injecteurs (high viscosity extruder, ou HVE ; gas dynamic virtual nozzle, ou GDVN). Plusieurs campagnes de collectes de données de diffraction ont été réalisées, soit au sein du synchrotron européen (ESRF), pour les expériences de cristallographie non résolue dans le temps, soit au sein de lasers à électrons libres X (ou XFELs) pour les expériences de cristallographie résolue dans le temps (SACLA, LCLS, EuXFEL et SwissFEL). Afin de mieux comprendre la photoactivation de CarH, nous avons en sus réalisé avec notre consortium (IBS, ESRF, Université de Manchester, Université de Louisville) des expériences complémentaires de diffusion des rayons X résolue dans le temps (time-resolved solution scattering, de spectroscopie d'absorption transitoire (transient absorption spectroscopy) et des calculs de prédiction de structures à l’état excité, grâce à la QM/MM. En combinant l’ensemble de ces informations, nous avons pu caractériser la séquence d’évènements chimiques et structuraux qui permettent, en suite de l’absorption du photon actinique, la dissociation du tétramère de CarH sur une échelle de temps allant de la nanoseconde jusqu’à la seconde.Parallèment nous avons, dans le contexte de nos précaractérisations, testé, caractérisé et démontré la possible utilisation d’un nouvel hydrogel, dérivé de la guanisine, pour des injecteurs HVE. Certains paramètres, tel que sa viscosité, sa capacité à former un jet stable et sa relative inoffensivité pour les microcristaux de protéines ont été étudiés. Le potentiel de cet hydrogel pour de futures études de (TR)-SFX a été montré en utilisant des cristaux de lysozyme.

The research performed in this thesis seeks primarily to elucidate the mechanism of B12 photoreceptors by using an integrated structural-dynamic and kinetic approach. The main system studied in this work is the CarH photoreceptor. CarH is a gene regulator photoreceptor that binds to operator DNA in bacteria in a tetrameric complex to inhibit gene expression. The suppressed gene controls carotenoid production that protects bacteria from sunlight radiation damage. The tetramer is stable in dark conditions and dissociates when it is exposed to light. The monomerization leads to a dissociation from the DNA, therefore allowing gene transcription to occur. The CarH photoreceptor hosts a B12 derivative chromophore (AdoCbl) which senses light, thus regulating gene expression. We focused on the chromophore binding domain (TtCBD) of the Thermus thermophilus CarH. We employed X-ray crystallography, specifically time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) as the main technique, for studying structural changes in TtCBD in real time. This thesis addresses key challenges and enhances methodologies across the entire experimental workflow for TR-SFX experiments, from sample preparation to data collection and processing. We report on the development of standardized protocols for obtaining seeded TtCBD microcrystals. We investigated and optimized different media (cellulose, lipidic cubic phase, grease) and methods for injecting and delivering microcrystals (high viscosity extruders, gas dynamic virtual nozzles, and fixed targets) while preserving their quality and photosensitivity. In terms of data collection, the thesis involves conducting static experiments at the ESRF synchrotron using macrocrystals of TtCBD and performing time-resolved experiments at various XFEL facilities (SACLA, LCLS, EuXFEL and SwissFEL). To further understand CarH photoactivation we have employed different techniques in collaboration, such as time-resolved solution scattering, transient absorption spectroscopy, and QM/MM calculations. We have elucidated structural and chemical changes following photon absorption up to tetramer dissociation on the ns to s timescale.In the last part of this thesis, we introduce and characterize a novel viscous medium for high-viscosity extrusion (HVE) injection, based on guanosine derivatives hydrogels. Guanosine and guanosine-5’-monophosphate self-assemble into G-quartets, forming three-dimensional G-quadruplexes (G4) that create stable, viscous hydrogels with up to 99% water content. Our research focused on utilizing G4 hydrogels as a crystal-carrier matrix for SFX experiments. We investigated the hydrogel's viscosity, jet generation, stability with protein crystallants, and ability to preserve microcrystals and enable photoactivation. We compared the G4 hydrogel’s X-ray background scattering at the ESRF ID29 beamline with other known media. Finally, we tested diffraction using this carrier medium with lysozyme microcrystals at SACLA, proving that we can obtain meaningful crystallographic data revealing the hydrogel's effectiveness, highlighting its potential TR- SFX studies.This thesis is part of a collaborative consortium involving laboratories from IBS Grenoble, the ESRF, the University of Manchester, and the University of Louisville.