Comprendre l'interaction fonctionnelle de VASH-SVBP avec les microtubules et leur régulation par la phosphorylation

Understanding the functional interaction of VASH-SVBP with microtubules and their regulation by phosphorylation

• Auteur / Autrice : Chadni Sanyal
• Direction : Marie-Jo Moutin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences neurobiologie
• Date : Soutenance le 04/07/2024
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Régulation neuropathologies et dysfonctions synaptiques (Grenoble ; 2011-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des neurosciences de Grenoble
• Jury : Président / Présidente : Rémy Sadoul
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Lucie Carrier, Didier Portran
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Charlotte Aumeier, Coralie Fassier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes

Neurones

Cardiomyocytes

Protéines -- Modifications posttraductionnelles

Microtubules

Mots clés libres

Enzyme

Neurone

Cytosquelette

Modification post-Traductionnelles

Cardiomyocytes

Microtubule

Neurons

Enzyme

Cytoskeleton

Cardiomyocytes

Microtubule

Post-Translational modifications

Résumé

Les microtubules (MT) sont des composants essentiels du cytosquelette eucaryote, formés de dimères de tubuline alpha (α) et bêta (β). Ils jouent un rôle crucial dans diverses fonctions cellulaires telles que la division, la motilité et la morphogenèse, et sont particulièrement importants pour le développement des neurones et la contraction des cardiomyocytes. Les MT sont régulées par le ''code tubuline'', qui englobe les variations de la composition de l'hétérodimère α/β tubuline par le biais des isoformes de tubuline et de leurs modifications post-traductionnelles (PTM).L'une des PTM d'intérêt est le cycle de détyrosination/tyrosination au cours duquel le résidu tyrosine C-terminal de l'α-tubuline est succéssivement éliminer et ré-additionné. Il est piloté par les enzymes tubuline carboxypeptidases (TCP) et tubuline tyrosine ligase (TTL). En 2017, notre groupe a identifié les complexes VASH1/2-SVBP (vasohibine et son chaperon, la petite protéine de liaison à la vasohibine) comme étant des TCPs majeures. Des déséquilibres dans ce cycle sont liés à des maladies telles que la neurodégénérescence et l'insuffisance cardiaque. Suite à l'élucidation de la structure cristalline de VASH-SVBP en 2019, l'objectif de mon doctorat était de comprendre les mécanismes régissant l'interaction de l'enzyme avec les MTs et leur régulation.Grâce à la microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRF-M) à molécule unique et à des essais d'activité de détyrosination, et en utilisant plusieurs mutants tronqués et chimères, nos résultats ont dévoilé des schémas de liaison distincts pour VASH1 et VASH2 sur les MTs stabilisées par le taxol. VASH1 présente une détyrosination globale, tandis que VASH2 a une activité très localisée. Ce comportement est attribué aux interactions de leurs régions N- et C-terminales désordonnées avec les MTs. La région N-terminale de VASH2 est responsable de son temps de résidence plus long et de sa diffusion moindre sur les MT, ce qui explique son activité localisée. En revanche, pour VASH1, la région N-terminale contribue à la diffusion et au détachement du complexe enzymatique des MT avec un temps de séjour plus court, conduisant à une activité plus globale.Un examen plus approfondi a révélé que les interactions électrostatiques jouent un rôle central dans les mécanismes d'action distincts des deux complexes. Cela laisse entrevoir l'impact possible de la phosphorylation sur le comportement de ces enzymes. En utilisant des études in vitro, nous avons révélé qu'une kinase spécifique peut phosphoryler le domaine C-terminal de VASH1 et les domaines C- et N-terminaux de VASH2, qui sont également leurs domaines d'interaction avec les MTs. Grâce à une analyse par spectrométrie de masse et l'utilisation de mutants, nous avons mis en évidence un site important de phosphorylation de VASH1 qui régule son activité et sa liaison au microtubules. Ces résultats pourraient avoir des implications majeures dans les neurones et les cardiomyocytes.En résumé, les recherches que j'ai menées au cours de mon doctorat ont permis de comprendre comment les microtubules sont modifiés différemment par les enzymes de détyrosination VASH1/2-SVBP et comment la phosphorylation est un mécanisme de régulation de leur fonction.

Microtubules (MTs) are vital components of the eukaryotic cytoskeleton, comprising alpha (α) and beta (β) tubulin dimers. They are crucial for various cellular functions like division, motility, and morphogenesis, and particularly significant in neuron development and cardiomyocyte contraction. MTs are regulated by the ''tubulin code,'' which encompasses variations in α/β tubulin heterodimer composition through tubulin isoforms and their post-translational modifications (PTMs).One of the PTMs of interest is the detyrosination/tyrosination cycle, involving the cyclic removal and re-addition of the C-terminal tyrosine residue of α-tubulin, driven by enzymes tubulin carboxypeptidases (TCPs) and tubulin tyrosine ligase (TTL) respectively. In 2017, our group identified vasohibin (VASH1/2) along with its chaperone, the small vasohibin binding protein (SVBP) as major TCPs. Imbalances in this cycle are linked to diseases such as neurodegeneration and heart failure. Following the elucidation of the crystal structure of VASH1/2-SVBP in 2019, the objective of my PhD was to understand the mechanisms governing the enzyme's interaction with MTs and their subsequent regulation.Through single-molecule total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) and detyrosinating activity assays, and using several truncated mutants and chimeras, our results unveiled distinct binding patterns for VASH1 and VASH2 on taxol-stabilised MTs. VASH1 exhibits global detyrosination, while VASH2 has a very localized activity. This behaviour is attributed to their disordered N- and C-terminal regions' interactions with MTs. The N-terminal region of VASH2 is accountable for its longer residence time, and less diffusion on MTs leading to its localised activity. Whereas for VASH1, the N-terminal aids in the diffusion and detachment of the enzyme complex from MTs with a shorter residence time, leading to its global activity.Further investigation divulged that electrostatic interactions play a pivotal role in their distinct mechanisms of action. This hinted at the possible impact of phosphorylation in further influencing VASH behaviour. Using in-vitro studies, we revealed that a specific kinase can phosphorylate the C-terminal domain of VASH1 and the C- and N-terminal domains of VASH2, which are also their domains of interactions with MTs. Owing to mass spectrometry and mutational analysis, we disclosed an important site for VASH1 phosphorylation regulating its detyrosination activity and MT binding behaviour. Such results may have major implications in neurons and cardiomyocytes.In summary, my research during PhD sheds light on how microtubules are modified differently by detyrosinating enzymes and on phosphorylation as a regulatory mechanism for their function.