Etude des mécanismes d’assemblage du site actif de la nitrogénase

Assembly machinery of the nitrogenase active site

• Auteur / Autrice : Tu Quynh Nguyen
• Direction : Yvain Nicolet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 12/01/2024
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Marc Jamin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : David Pignol, Sandrine Ollagnier-de Choudens
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Myriam Seemann, Benoît D'Autréaux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métalloprotéines

Réactions chimiques -- Mécanismes

Cristallographie

Mots clés libres

Cristallographie

Mécanisme réactionnel

Métalloprotéine

Crystallography

Metalloproteins

Chemical mechanism

Résumé

La fixation de l’azote, qui convertit l’azote atmosphérique (N2) en ammoniac (NH3) facilement utilisable par les plantes et autres organismes, est un processus fondamental pour la vie sur Terre. Elle fournit l’azote nécessaire à la synthèse de composants cellulaires essentiels tels que les acides nucléiques ou les protéines. A l’échelle industrielle, le procédé Haber-Bosch est couramment utilisé pour produire de l’ammoniac. Cependant, cette méthode est énergivore et contribue de manière significative aux émissions mondiales de gaz à effet de serre. En revanche, la nature a développé une solution basée sur l’utilisation d’une enzyme : la nitrogénase, capable de catalyser cette transformation dans des conditions ambiantes. La nitrogénase est une enzyme complexe constituées de deux composants principaux : la protéine MoFe ou NifD2K2, et la protéine Fe ou NifH2. NifD2K2 contient le site actif, connu sous le nom de FeMo-cofacteur (FeMo-co), un centre [7Fe-9S-C-Mo-(R)-homocitrate], où se produit la réduction de N2 en NH3.L’assemblage de FeMo-co implique une série d’étapes complexes orchestrées par la machinerie de fixation de l’azote (NIF). Ma thèse de doctorat se concentre sur l’étude de la relation structure-fonction de deux composants centraux de cette machinerie : l’enzyme à radical S-adenosyl-L-methionine (SAM) NifB responsable de la synthèse d’un cluster [8Fe-9S-C] appelé NifB-co – un précurseur central de FeMo-co, et la protéine scaffold NifE2N2, qui reçoit NifB-co et facilite sa conversion en FeMo-co.La fonction de NifB est complexe et implique la coordination de plusieurs centres [4Fe-4S] : un cluster radical SAM et deux clusters substrats appelés K1 et K2. En utilisant la cristallographie aux rayons X, nous avons confirmé que les régions N-terminale et C-terminale possédaient une flexibilité en fonction de la fixation de K1 et K2, respectivement. Cette flexibilité joue potentiellement un rôle dans la réception de ces clusters ainsi que leur conversion, puis dans le transfert du produit NifB-co vers les protéines partenaires de la machinerie. De plus, en utilisant la mutagenèse dirigée et la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE), nous avons montré que les clusters K1 et/ou K2 subissent des modifications lors de la réduction, suggérant la formation d’un intermédiaire avant le transfert de méthyle et l’insertion de carbure. La nature précise de cet intermédiaire fait l’objet de nos investigations en cours. Enfin, nos analyses des séquences et des structures de NifB, combinées à la spectroscopie RPE, ont permis l’indentification de résidus glutamate et cystéine comme ligands potentiels partagés entre K1 et K2 avant leur fusion.En outre, nos investigations sur l’interaction dynamique entre NifE2N2 et NifB ont fourni des informations importantes sur la machinerie. Leur interaction directe avait été proposée pour le transfert de NifB-co de NifB à NifE2N2. Nos études suggèrent que ce processus dépend plus probablement de la protéine NifX ou du domaine NifX-like C-terminal présent dans de nombreuses protéines NifB, plutôt que du domaine SAM radical de NifB lui-même. De plus, nos études structurales et fonctionnelles de NifE2N2 ont identifié des résidus de cystéine clés directement impliqués dans le transfert et la fixation de NifB-co. Les résultats préliminaires de cryo-EM ont également montré un nouvel environnement pour la fixation de NifB-co dans NifE2N2, rappelant celui du FeMo-co dans NifD2K2. Ces résultats éclairent les changements structuraux que NifE2N2 effectue pour accueillir ces cofacteurs complexes.En résumé, bien qu’il reste encore de nombreux défis, l’étude de la relation structure-fonction des protéines NifB et NifE2N2 contribue à notre compréhension de l’assemblage du site actif de la nitrogénase, ce qui peut à son tour aider à inspirer le développement de catalyseurs plus efficaces pour la conversion de N2 en NH3 dans des conditions ambiantes.

Nitrogen fixation, the process of converting atmospheric nitrogen (N2) into ammonia (NH3) that can be readily used by plants and other organisms, is a fundamental process for life on Earth. It provides the necessary nitrogen for the synthesis of essential cellular components such as proteins and nucleic acids. On an industrial scale, the Haber-Bosch process is commonly used to produce ammonia. However, this method is energy-intensive and significantly contributes to global greenhouse gas emissions. In contrast, nature has devised a more sustainable solution using nitrogenase, an enzyme able to catalyze this transformation under ambient conditions. Nitrogenase is a complex enzyme that consists of two main components: the MoFe protein or NifD2K2, and the Fe protein or NifH2. NifD2K2 contains the active site, known as FeMo-cofactor (FeMo-co), a [7Fe-9S-C-Mo-(R)-homocitrate] center, where the actual reduction of N2 to NH3 takes place.The assembly of FeMo-co involves a series of complex steps orchestrated by the nitrogen fixation (NIF) machinery, which ensures the precise assembly of different precursors leading to the active site. My PhD thesis focuses on understanding the structure-function relationship of two central components in this machinery: the radical S-adenosyl-L-methionine (SAM) enzyme NifB responsible for the synthesis of a [8Fe-9S-C] cluster termed NifB-co – a core precursor to FeMo-co, and the scaffold protein NifE2N2, which receives NifB-co and facilitates its conversion to FeMo-co.The function of NifB is complex and involves the coordination of multiple [4Fe-4S] clusters: a radical SAM cluster and two substrate clusters termed K1 and K2. Using X-ray crystallography, we have confirmed that the N-terminal and the C-terminal regions displayed a flexibility depending on the binding of K1 and K2, respectively. This flexibility likely plays a role in the housing and conversion of these substrate clusters as well as the transfer of the product NifB-co for further processing. Moreover, using site-directed mutagenesis and electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy, we have shown that K1 and/or K2 clusters underwent modifications upon reduction, suggesting the formation of an intermediate before methyl transfer and carbide insertion. The precise nature of this intermediate is a focus of our ongoing investigations. In addition, our analyses of NifB sequences and structures, combined with EPR spectroscopy, revealed a glutamate and a cysteine as potential shared ligands between K1 and K2 prior to their fusion.Furthermore, our investigations on the dynamic interaction between NifE2N2 and NifB provided important insights into the nitrogen fixation machinery. Their interaction was suggested to be involved in the transfer of NifB-co from NifB to NifE2N2. However, our studies have suggested that this process likely depends on the NifX protein or the C-terminal NifX-like domain present in many NifB proteins, rather than the NifB radical SAM domain itself. Furthermore, our structural and functional studies of NifE2N2 identified two key cysteine residues directly involved in the transfer and binding of NifB-co. Preliminary cryo-EM results also showed a new environment for NifB-co binding in NifE2N2, reminiscent to that of FeMo-co binding in NifD2K2. These findings shed light on the structural changes that NifE2N2 undergoes to house complex cofactors.In summary, while many challenges remain, the study of the structure-function relationship of NifB and NifE2N2 proteins contributes to our understanding of the assembly of the nitrogenase active site, which in turn may help inspire the development of more efficient catalysts for the conversion of N2 into NH3 under ambient conditions.