Rôle de l'interaction entre 53BP1 et l'ARN dans la réplication de l'ADN

Role of 53BP1-RNA interaction in DNA Replication

• Auteur / Autrice : Clara Bonnet
• Direction : Patricia Uguen, Stéphan Vagner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 10/10/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome, ARN et cancer (2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Hervé Le Hir
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patricia Uguen, Stéphan Vagner, Jean-Charles Cadoret, Evi Soutoglou, Annabel Quinet De Andrade
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Charles Cadoret, Evi Soutoglou

Mots clés

Mots clés libres

53bp1

Fragments d'Okazaki

Réplication de l'ADN

Protéine de liaison à l'ARN

53bp1

Okazaki fragments

DNA Replication

RNA-Binding protein

Résumé

Au cours de cette décennie, des centaines de protéines de liaison à l’ARN (RBP) ont été identifiées. Les interactions ARN-protéines sont essentielles pour de nombreux processus cellulaires, de la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes au maintien de l’intégrité du génome. La réplication de l’ADN est un mécanisme critique pour la stabilité du génome et des défauts peuvent entraîner des pathologies. Par ailleurs, des ribonucléotides sont produits pendant la réplication de l'ADN et plusieurs RBP sont présentes aux fourches de réplication. Cependant, leur interaction avec l’amorce ARN, présente dans la matrice d’ADN, reste inexplorée. En utilisant des techniques in vitro et des méthodes de couplage induites par les UV-C dans des cellules humaines, le laboratoire a identifié 53BP1 (p53-binding protein 1), impliquée dans la réponse aux dommages de l'ADN et au stress réplicatif, comme une RBP qui interagit directement avec des molécules d'ARN-ADN, semblables aux amorces ARN-ADN synthétisées sur le brin retard pour former les fragments d’Okazaki (OF). L’objectif de ma thèse était alors de mieux caractériser l’interaction entre 53BP1 et les OF et de comprendre son rôle durant la réplication de l’ADN. Nous avons montré que la partie C-terminal de 53BP1 est la région minimale de liaison à l’ARN. De plus, en utilisant une variété d'approches pour étudier l'association des protéines avec l'ADN naissant pendant la phase S, nous avons montré que le recrutement de 53BP1 aux fourches de réplication était diminué lors du traitement avec la ribonucléase A ou lors de la déplétion de PRIM1, la sous-unité catalytique de la primase. En revanche, la déplétion de l'endonucléase FEN1, qui entraîne l'accumulation d'amorces d'ARN non clivées, a conduit à une présence accrue de 53BP1 à la fourche. En outre, nous avons constaté que la déplétion de 53BP1 induisait une accumulation de poly(ADP-ribose) en phase S, qui constitue un senseur des OF non ligaturés, et à une diminution du recrutement de RPA/DNA2 à l’ADN naissant, qui sont des facteurs de la maturation des OF.Dans l'ensemble, ces résultats montrent que 53BP1 interagit avec les OF pour aider à la maturation du brin retard, soulignant le rôle d'une nouvelle interaction ARN-protéine au niveau des fourches de réplication de l'ADN.

Over the last decade, hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) have been identified. The RNA-protein interactions are essential for many cellular processes, from post-transcriptional regulation of gene expression to maintenance of genome integrity. DNA replication is a critical mechanism in genome stability and defects can lead to diseases. Furthermore, ribonucleotides are produced during DNA replication and several RBPs are found at replication forks. However, their interaction with the RNA primer, present in the DNA template, remains unexplored. Using in vitro assays and UV-C-induced crosslink methods in living human cells, the laboratory identified 53BP1 (p53-binding protein 1), involved in the response to DNA damage and replication stress, as an RBP that directly interacts with RNA-DNA species, similar to the RNA-DNA primers synthesized on the lagging strand to form the Okazaki fragments (OF). The aim of my thesis was to better characterise the interaction between 53BP1 and OF and to understand its role during DNA replication.We found that the C-terminal part of 53BP1 is the minimum RNA-binding region. Furthermore, using a variety of approaches to study the association of proteins with nascent DNA during S-phase, we showed that the recruitment of 53BP1 to replication forks was decreased upon treatment with ribonuclease A or upon depletion of PRIM1, the catalytic subunit of primase. In contrast, depleting the endonuclease FEN1, which results in the accumulation of uncleaved RNA primers, led to an increased presence of 53BP1 at the fork. In addition, we found that 53BP1 depletion induced an accumulation of S-phase poly(ADP-ribose), which constitutes a sensor of unligated OF, and led to reduced DNA2/RPA loading at nascent DNA, which are factors of OF maturation.Altogether, these results show that 53BP1 interacts with OF to help in the processing of lagging strand, highlighting the role of a novel RNA-protein interaction at DNA replication forks.