Thèse soutenue

Nouvelles stratégies immunothérapeutiques contre le Sarcome d’Ewing

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Auteur / Autrice : Céline Maria Collin
Direction : Olivier Delattre
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences du Cancer
Date : Soutenance le 31/10/2023
Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité - Cancer, Hétérogénéité, Instabilité et Plasticité (U830)
établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
Jury : Président / Présidente : Eric Tartour
Examinateurs / Examinatrices : Olivier Delattre, Françoise Redini, Olivier Lantz, Nathalie Gaspar, Ana Lalanne
Rapporteurs / Rapporteuses : Eric Tartour, Françoise Redini

Résumé

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Le Sarcome d'Ewing (SE), seconde tumeur osseuse pédiatrique, se caractérise par la translocation chromosomique équilibrée t (11 ;22) (q24 ;q12) entre les gènes EWSR1 (famille FET) et FLI1 (famille ETS) dans 85% des cas. Cette translocation conduit à l’expression de la protéine chimérique EWSR1-FLI1, facteur de transcription pionnier capable de se lier à des motifs GGAA via le domaine de liaison à l’ADN de FLI1 et d’induire la formation de régions « Enhancer » de novo. Ce mécanisme induit l'expression d'un ensemble spécifique de nouveaux transcrits épissés et polyadénylés dans des régions du génome normalement silencieuses. Ces néotranscrits spécifiques au SE sont activés par EWSR1-FLI1 et présentent des caractéristiques de lncRNAs (long non-coding RNAs). Nous montrons que l’expression de ces transcrits est spécifique des séquences GGAA en les ciblant par un système de CRISPRi KRAB en amont du néogène d’intérêt. De plus, leur expression est régulée par la protéine EWSR1-FLI1 dans un modèle cellulaire shRNA (short hairpin RNA) inductible à la Doxycycline.L’objectif de ce projet est de déterminer si ces néotranscrits sont traduits et présentés par le CMH de classe I des cellules du SE, constituant ainsi une source de néo-Ags (néoantigènes) immunogènes spécifiques du SE.A partir d’un séquençage d’ARN short read de cellules d’Ewing, une base de données prédictive d’Open Reading Frames (ORFs) a été générée. De nouvelles ORFs non annotées (nuORFs) ont été détectées par ribosome profiling dans plusieurs échantillons d’Ewing. Nous avons ensuite cherché à caractériser l’immunopeptidome de classe I de plusieurs échantillons de SE afin de détecter des peptides issus de la traduction des nuORFs spécifiques du SE et pouvant constituer une source de néo-Ag spécifiques de la tumeur d’Ewing. Certains de ces peptides correspondent à des séquences d’ORFs prédites de la base de données et montrent une excellente liaison au HLA d’intérêt après synthèse in vitro.Nous avons ensuite déterminé l’immunogénicité de ces peptides candidats à partir de lymphocytes T CD8+ de donneurs sains. Après marquage par la méthode de tétramères couplés aux peptides d’intérêt, les lymphocytes CD8+ affins sont clonés et des tests d’avidité sont effectués avec des concentrations croissantes de peptides synthétiques. Ces clones, si leur avidité le permet, sont ensuite utilisés pour confirmer la présentation des peptides candidats par les cellules d’Ewing et tester leur immunogénicité naturelle. A ce jour, un clone a montré une avidité suffisante pour tester la présentation naturelle et l’immunogénicité de son peptide d’intérêt, confirmant la présentation de ce peptide par le CMH I des cellules d’Ewing. La recherche de lymphocytes T CD8+ affins s’est également déroulée en amont à partir de peptides issus de prédictions NetMHCpan en utilisant la base de données d’ORFs prédites sans validation par immunopeptidomique. Des Lymphocytes T CD8+ issus de donneurs sains ont montré une bonne avidité pour les peptides synthétiques mais n’ont pas été stimulés naturellement par les cellules d’Ewing. Notre démarche montre l’apport crucial de la validation d’antigènes présentés par le CMH I par immunopeptidomique pour la découverte d’antigènes tumoraux.La prise en charge actuelle (associant la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie) est peu efficace sur les formes métastasées et présente des effets secondaires au long cours. Les immunothérapies, par leur spécificité d’action, constituent un espoir pour le traitement du SE. Ces néo-Ag candidats présentés par le CMH de classe I spécifiques du SE ainsi caractérisés constituent une nouvelle source de cibles thérapeutiques. De nouveaux peptides sont en cours de validation afin de tester leur immunogénicité.