Le rôle de la méthylation de l'ADN dans la spécification et le maintien de l'identité et la fonction des centromères

How DNA methylation helps specify and maintain centromere identity and function

• Auteur / Autrice : Catalina Salinas Luypaert
• Direction : Daniele Fachinetti
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 06/10/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Mécanismes moléculaires du développement de la glande mammaire
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Geneviève Almouzni
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Daniele Fachinetti, William C. Earnshaw, Sylvia Erhardt, Ines Anna Drinnenberg, Pierre-Antoine Defossez
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : William C. Earnshaw, Sylvia Erhardt

Mots clés

Mots clés libres

Centromère

Méthylation de l'ADN

Épigénétique

Cenp-A

Cenp-B

Stabilité du genome

Centromere

DNA methylation

Epigenetics

Cenp-A

Cenp-B

Genome stability

Résumé

Le maintien de l'intégrité du génome et la transmission correcte de l'information génétique à chaque division cellulaire sont des étapes clés pour la survie de tous les organismes vivants. Chez les mammifères, la méthylation de l'ADN (ADNme) et le maintien de la fidélité de la ségrégation des chromosomes sont des déterminants majeurs de la stabilité du génome. L’ADNme est une marque épigénétique essentielle qui joue un rôle central dans la régulation du génome. En plus d’inhiber les transpositions et la recombinaison, c’est le principal mécanisme de répression de l'expression des éléments répétés. La ségrégation des chromosomes est médiée par le centromère, un domaine chromosomique spécialisé où le kinétochore s'assemble pour attacher les chromosomes au fuseau mitotique. Le bon fonctionnement des centromères est essentiel à la préservation du caryotype dans toutes les cellules en division. Les centromères sont entourés par des domaines péricentriques présentant des caractéristiques de l'hétérochromatine et sont assemblés sur de l'ADN satellite auquel se lie la protéine centromérique B (CENP-B). L'ADN centromérique et péricentromérique est fortement méthylé, à l'exception notable des domaines enrichis en CENP-A, la variante de l'histone H3 qui définit épigénétiquement la position des centromères et dont la régulation est déterminante pour leur fonction.Des altérations pathologiques des patrons de méthylation de l'ADN et de la fonction du centromère ont été associées à l'instabilité chromosomique dans le cancer et dans le syndrome ICF (Immunodéficience, instabilité Centromérique et dysmorphie Faciale), une maladie génétique rare. Le lien fonctionnel entre l'hypométhylation de l'ADN centromérique et le dysfonctionnement du centromère reste cependant à être établi. Notre hypothèse est que l'ADNme est un déterminant majeur de l'identité du centromère, et que l'hypométhylation des centromères conduit à un assemblage défectueux du réseau protéique centromérique, ce qui impacte leur fonction.En utilisant des outils cellulaires pour l’invalidation génique des ADN méthyltransférases DNMT1 et DNMT3B, j’ai démontré les mécanismes de régulation de l'ADNme au niveau des centromères humains et l'impact de la réduction de l'ADNme sur la physiologie des centromères. Pour aborder directement le lien entre l'ADNme et la fonction du centromère, j'ai généré des outils cellulaires pour induire une déméthylation ciblée de l'ADN centromérique. Le niveau d'ADNme centromérique peut être réduit jusqu'à 85% sans affecter la méthylation des péricentromères. Cette diminution de l'ADNme centromérique entraîne une instabilité du génome, avec formation de micronoyaux à l’issue d’une ségrégation incorrecte des chromosomes, et une létalité cellulaire. CENP-A et CENP-B, deux des protéines centrales de la chromatine centromérique, augmentent au niveau des centromères hypométhylés, ce qui explique en partie l'instabilité génomique observée dans ces cellules. La déméthylation de l'ADN centromérique n'est pas réversible et provoque à long terme un processus d'adaptation cellulaire. Certaines cellules parviennent à continuer à proliférer avec des niveaux d'ADNme centromérique plus faibles et des niveaux de CENP-A et de CENP-B stablement plus élevés au niveau des centromères. Enfin, j’ai identifié que l’ADNme peut servir de frontière pour délimiter la formation épigénétique des centromères médiée par CENP-A en préservant la position du centromère et en empêchant l'élargissement du domaine occupé par CENP-A. Dans l'ensemble, j'ai démontré qu'il existe un lien direct entre l’ADNme centromérique et l'identité et la fonction du centromère, tout en fournissant les premières preuves d'une relation fonctionnelle entre ces deux facteurs déterminants pour la stabilité du génome. Ce travail établit les bases de notre compréhension de la façon dont la perte d'ADNme centromérique peut être à l'origine de l'instabilité du génome observée dans le cancer et le syndrome ICF.

In all living organisms, maintaining genome integrity and ensuring the proper transmission of genetic information in each cell division are key steps for a healthy development and survival. In mammals, both DNA methylation (DNAme) and the maintenance of chromosome segregation fidelity are known to be major determinants of genome stability. DNAme is an essential epigenetic mark that plays a central role in genome regulation as it is the major mechanism responsible for silencing the expression of repetitive elements, and it inhibits transpositions and recombination. Chromosome segregation is mediated by the centromere, a specialized chromosomal domain where the kinetochore assembles in mitosis to attach the chromosomes to the spindle microtubules. The proper function of the centromeres is essential for the preservation of a correct karyotype in all dividing cells. In most eukaryotes, the centromeres are often embedded into pericentric domains with hallmarks of heterochromatin and they are assembled on large arrays of tandemly repeated satellite DNA bound by CENtromeric Protein B (CENP-B). Both the centromeric and the pericentromeric DNA are highly methylated, with the notable exception of the domains where CENP A is enriched. CENP-A is the histone H3 variant that defines epigenetically the position of the centromeres, and its tight regulation is known to be key for centromere function.Pathological alterations of DNA methylation patterns and centromere function have been associated to chromosomal instability in cancer and in the Immunodeficiency, Centromeric region instability and Facial anomalies (ICF) syndrome, a rare genetic disease. The functional link between centromeric DNA hypomethylation and centromere dysfunction remains however to be formally established. We hypothesize that DNAme is a major determinant of centromere identity, and that pathological hypomethylation of the centromeres leads to a deficient assembly of the centromeric protein network, which then impacts centromere function.Using cellular tools to remove the DNA methyl transferases DNMT1 and DNMT3B I demonstrate the mechanisms regulating the DNAme at human centromeres and the impact of DNAme reduction on centromere physiology. To directly address the link between DNAme and centromere function, I have generated cellular tools to induce a targeted centromeric DNA demethylation and have demonstrated that they are centromere-specific and tunable. The centromeric DNAme level can be reduced up to 85% without affecting the methylation of the neighboring pericentromeres. This decrease of centromeric DNAme causes genome instability, with formation of micronuclei as a readout of chromosome mis segregation, and cell lethality. CENP-A and CENP-B, two of the core proteins of the centromeric chromatin, increase at the centromeres upon hypomethylation, partially accounting for the genome instability observed in these cells. The demethylation of the centromeric DNA is not reversible, and in the long-term prompts a process of cellular adaptation at the cell population level: despite initially causing lethality, some cells manage to continue to proliferate with lower centromeric DNAme levels at and with stably higher CENP-A and CENP-B levels at the centromeres. Finally, I reveal that DNAme can act as a boundary for the epigenetic, CENP-A-mediated formation of the centromeres by preserving centromere position and preventing the enlargement of the domain occupied by CENP-A. Overall, I have demonstrated that there is a direct link between the centromeric DNAme and centromere identity and function, providing the first evidence of a functional relationship between these two determinant factors for genome stability. This work sets the foundation of our understanding on how loss of centromeric DNAme can be at the root of the genome instability observed in cancer and the ICF syndrome.