PTMomics : Microfluidique pour l'étude des modifications post-traductionnelles : application à la glycoprotéomique

PTMomics : Microfluidics for post-translational modifications studies : application to glycoproteomics

• Auteur / Autrice : Zeyuan Xu
• Direction : Joëlle Vinh, Yann Verdier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Analytique
• Date : Soutenance le 08/02/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Plasticité du cerveau (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Jury : Président / Présidente : Didier Thiébaut
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Delphine Pflieger, Charles Pineau, Sarah Cianférani-Sanglier, Yves Combarnous
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Delphine Pflieger, Charles Pineau

Mots clés

Mots clés libres

Glycosylation

Lectines

Microfluidique

PNGase

Matrice MALDI

NanoLC-MS/MS

Glycosylation

Lectin

Microfluidics

PNGase

MALDI matrix

NanoLC-MS/MS

Résumé

Les glycoprotéines jouent un rôle fondamental dans la vie. Des études récentes montrent qu'elle est largement présente dans les activités biologiques, telles que la liaison des récepteurs, la signalisation cellulaire, la réponse immunitaire, le repliement des protéines et l'action des hormones. Parallèlement, la glycosylation des protéines a été associée au pronostic et à l'évolution de maladies comme les cancers. Ainsi, elle devient un biomarqueur important, et est également significative pour le développement thérapeutique. La glycosylation mérite donc d'être étudiée en détail. La glycoprotéine acquiert sa fraction d'hydrate de carbone par un processus appelé modification post-traductionnelle (PTM). Ce qui est différent de la plupart des PTM, c'est qu'il existe plusieurs formes de glycosylation. Les glycosylations N- et O-liées sont parmi les types les plus courants. D'autres comme la C-mannosylation et la phosphosérine sont rares. Si l'on considère simplement la glycosylation liée à l'azote, on peut la diviser en types complexes, hybrides et à haute teneur en mannose, qui résultent d'une synthèse non dirigée par un modèle. Sur la membrane du RE, un oligosaccharide sur Dol-PP est transféré à Asn dans la séquence Asn-X-Thr/Ser (X n'est pas la proline). Ensuite, les glycosidases et les glycosyltransférases agissent pour éliminer le glucose et ajouter une fraction de sucre dans le RE et le Golgi. Leurs activités dépendent des espèces, des types de cellules, des protéines, des sites et de l'état physiologique de la cellule, ce qui donne lieu à divers glycanes N-liés. Et l'hétérogénéité sera un obstacle majeur à l'étude des glycoprotéines. Les informations sur l'occupation de plusieurs sites peuvent être compliquées par le faible rendement d'ionisation et la fragmentation (macro-hétérogène). Sur chaque site, de multiples glycoformes existent, ce qui entraîne une diminution du signal (micro-hétérogène). De nombreux efforts ont été investis pour résoudre ce problème. La spectrométrie de masse (MS) est maintenant progressivement appliquée à l'étude de la glycosylation des protéines pour sa sensibilité, sa vitesse et son haut débit. Le couplage avec un système de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une combinaison largement adoptée. Dans le même temps, des glycosidases, par exemple l'endo H et la PNGase F, sont découvertes et utilisées pour la libération des glycanes. La microfluidique est apparue pour le traitement des échantillons, et les approches hybrides sont de plus en plus populaires et devraient être la solution. En conclusion, pour une étude approfondie de sa fonction, l'occupation du site, la composition, la quantité et d'autres informations sont essentielles. Un protocole d'analyse amélioré doit être mis en œuvre pour acquérir spécifiquement ces informations à haute sensibilité, ce qui constitue le point d'ancrage de l'étude glycoprotéomique.

Glycoprotein acts as a fundamental undertaker of life. Recent studies show that it is widely found in biological activities, such as in receptor binding, cell signaling, immune response, protein folding, and hormone action. Meanwhile, protein glycosylation has been associated to prognosis and progress of diseases like cancers. Thus, it becomes an important biomarker, and as well as is significant to therapeutics development. Thus, glycosylation worth to be studied in detail. Glycoprotein gains its carbon hydrate moiety through a process so called post translational modification (PTM). What is different from most of the PTMs is that there are various forms of glycosylation. N- and O-linked glycosylation are among the most common types. Others like C-mannosylation and phosphoserine are rare. Merely looking at the N-linked glycosylation, it can be further divided into complex, hybrid, and high mannose types, which is a result of the non-template-driven synthesis. On the ER membrane, an oligosaccharide on Dol-PP is transferred to Asn in the sequence Asn-X-Thr/Ser (X is not proline). Then, glycosidases and glycosyltransferases act in to remove glucose and adding sugar moiety in ER and Golgi. Their activities depend on the species, cell types, protein, sites, and physiological state of the cell resulting in various N-linked glycans. And heterogeneity will be a major hurdle to study glycoprotein. Multiple sites occupancies information can be complicated by the poor ionization yield and fragmentation (macro-heterogenous). On each site, multiple glycoforms existed leading to even diminished signal(micro-heterogenous). Many efforts have been invested in to solve it. Mass spectrometry (MS) is now progressively applied to protein glycosylation study for its sensitivity, speed, and high throughput. The coupling with a high-performance liquid chromatography system (HPLC) is a widely adopted combination. In the meantime, glycosidase, for example, endo H and PNGase F are discovered and used for glycan release. Microfluidics emerged for sample treatment, and hybrid approaches are becoming increasingly popular and expected to be the solution. To conclude, for an in-depth study of its function, site occupancy, composition, quantity, and other information are essential. An improved analysis protocol should implemented to specifically acquire this information at high sensitivity, which is the anchor for glycoproteomic study.