La sous-unité B de la toxine de Shiga pour le développement d’immunothérapies anticancéreuses ciblées

The Shiga toxin B subunit for the development of targeted cancer immunotherapies

• Auteur / Autrice : Justine Hadjerci
• Direction : Ludger Johannes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 22/09/2023
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Chimie et biologie de la cellule (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Sagan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ludger Johannes, Jean-Christophe Cintrat, Nathalie Mignet, Karine Crozat
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-Christophe Cintrat, Nathalie Mignet

Mots clés

Mots clés libres

Vaccins thérapeutiques

Échappement endosomal

Ingénierie de protéine

Immunothérapies

Sous-Unité B de la toxine de Shiga

Ciblage thérapeutique

Therapeutic vaccines

Endosomal escape

Protein engineering

Immunotherapies

Shiga toxin B subunit

Therapeutic targeting

Résumé

L'un des défis majeurs rencontrés dans le développement de thérapies moléculaires est l’acheminement du médicament de manière spécifique à sa cible après administration au patient. Ceci est nécessaire pour induire un effet thérapeutique efficace mais aussi pour limiter la toxicité liée à une molécule délivrée au mauvais endroit. Dans le cadre des cancers, les vaccins thérapeutiques sont utilisés pour induire une réponse cytotoxique contre des marqueurs tumoraux spécifiques et ainsi aider l'organisme à combattre la tumeur. Pour cela, des antigènes doivent être délivrés aux cellules présentatrices d'antigène capables d'activer les lymphocytes T naïfs après présentation via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). En particulier, les cellules dendritiques (DC) sont capables d’induire les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques par le processus de présentation croisée lorsque les antigènes sont transloqués dans leur cytosol. La sous-unité B de la toxine Shiga (STxB) est exploitée depuis de nombreuses années par mon équipe hôte comme outil de délivrance d'antigènes au cytosol des DC. Cette protéine non toxique cible spécifiquement le glycolipide Gb3 qui est exprimé à la surface des DC. STxB présente la capacité de s’échapper de l’endosome pour atteindre le cytosol. La vectorisation des antigènes par STxB recombinante a déjà prouvé son efficacité à induire des réponses immunitaires plus fortes par rapport à l'antigène non vectorisé par STxB, conduisant à une inhibition de la croissance tumorale chez la souris. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur le développement de STxB en tant qu’outil de délivrance d’antigènes en utilisant deux stratégies : les vaccinations à base de protéines et à base d'acides nucléiques. D'une part, nous avons mis au point la production d’une STxB synthétique par synthèse chimique linéaire du monomère, suivie du repliement dans la forme homopentamérique. Nous avons pu obtenir une protéine fonctionnelle qui présente des propriétés biophysiques et un trafic rétrograde très similaire à la version recombinante. En collaboration avec l’équipe d’Eric Tartour (INSERM U970), nous avons montré après administration intranasale que la vectorisation d’un antigène par STxB synthétique induit une réponse immunitaire équivalente ou supérieure à celle obtenue par la vectorisation de l’antigène par STxB recombinante. Cette découverte a été validée avec différents peptides antigéniques et protéines entières, dans différents modèles de souris, et associés à divers adjuvants. D'autre part, j'ai exploité la synthèse de STxB pour optimiser sa capacité d'échappement endosomal pour un meilleur ciblage de molécules thérapeutiques au cytosol des DC. Par la fonctionnalisation de STxB avec des groupements hydrophobes, j'ai pu doubler son efficacité de translocation membranaire. Enfin, j'ai développé des vaccins ARNm codant pour des protéines de fusion STxB-antigène. En utilisant en collaboration avec l’équipe de Chantal Pichon (CNRS UPR 4301) une encapsulation à base de nanoparticules lipidiques, nous avons pu obtenir des réponses immunitaires cellulaires et humorales encourageantes après une administration intramusculaire de STxB fusionnée à un antigène modèle, l’ovalbumine. Dans le modèle EG7-OVA, nous avons montré que la croissance tumorale était considérablement diminuée après vaccination avec l'ARNm codant la fusion génétique STxB-OVA par rapport à la vaccination avec l'ARNm codant pour l'antigène seul. A travers ces différentes études, nous avons confirmé le grand intérêt de STxB en tant qu'outil de ciblage pour le développement de vaccins thérapeutiques contre le cancer ainsi que de vaccins prophylactiques contre les maladies infectieuses.

One of the major challenges encountered in the development of molecular therapies is the specific delivery of a drug to its target after administration to the patient’s body. This is required to induce an efficient therapeutic effect but also to limit toxicity linked to off-target effects. In the context of cancer, therapeutic vaccines are used to induce a cytotoxic CD8+ T cell response through the expression of tumoral antigens expressed by cancer cells and thereby help the body to restrain tumor growth. For this, antigen presenting cells prime naïve T lymphocytes through the presentation of specific antigens to the major histocompatibility complex (MHC). In particular, dendritic cells (DCs) are able to prime cytotoxic CD8+ T cells through the process of cross-presentation when antigens reach their cytosol. The B-subunit of Shiga toxin (STxB) has been exploited for many years by my host team as a tool for antigen delivery to the cytosol of DCs. This non-toxic protein specifically binds the glycolipid Gb3 which is preferentially expressed on DCs. STxB binding to Gb3 induces it’s endocytosis and it has the capacity of endosomal escape to reach the cytosol. Vectorization of antigens to recombinant STxB has been already proven to efficiency induce an immune response, when compared to non-vectorized antigen, leading to inhibition of tumor growth or viral infection in mouse models. During my PhD, I worked on the further development of STxB as an antigen delivery tool under 3 aims. The first, we achieved the production of synthetic STxB by the linear chemical synthesis of full length STxB monomers followed by their folding and assembly into homopentamers. We were able to obtain fully functional protein, which possesses biophysical properties and retrograde trafficking highly phenocopying recombinant STxB. Furthermore, in collaboration with Eric Tartour’s team (INSERM U970), we showed that after intranasal administration, antigen vectorization by synthetic STxB induces equivalent or even higher mucosal immune responses than those observed with recombinant STxB. This finding was validated with different antigenic peptides or full-size proteins (notably derived from SARS-CoV-2 Spike), in different mouse models, and associated with various adjuvants. The second aim, we mutated STxB to optimize its endosomal escape capacity for an enhanced delivery of therapeutic molecules to the cytosol of DCs. By functionalization of STxB with hydrophobic moieties, I was able to double its membrane translocation efficiency. Finally for the third aim, I developed mRNA vaccines encoding STxB-antigen fusion proteins. By using lipid nanoparticles encapsulation in collaboration with Chantal Pichon's team (CNRS UPR 4301), we were able to obtain strong cellular and humoral immune responses after intramuscular administration with STxB fused to the model antigen ovalbumin. We showed that tumor growth in the EG7-OVA model was considerably decreased after vaccination with mRNAs encoding the genetic fusion STxB-OVA, when compared to mRNAs encoding OVA alone. Through these various studies, we have developed STxB as a delivery tool for the development of therapeutic vaccines against cancer as well as prophylactic vaccines to prevent infectious diseases.