Thèse soutenue

Dispositif Complet de Préparation d'Echantillons pour l'Analyse Multi-Omique

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Auteur / Autrice : Ranjith Kumar Ravi Kumar
Direction : Yann Verdier
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie Analytique
Date : Soutenance le 08/03/2023
Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Plasticité du cerveau (Paris ; 2014-....) - Laboratoire Plasticité du Cerveau Brain Plasticity (UMR 8249)
établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
Jury : Président / Présidente : Andrew Griffiths
Examinateurs / Examinatrices : Yann Verdier, Martial Marbouty, Virginie Redeker, Pascal Cosette, Joëlle Vinh
Rapporteurs / Rapporteuses : Martial Marbouty, Virginie Redeker

Mots clés

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Résumé

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Les trois dernières décennies ont vu l'apparition du concept de microbiome, qui désigne l'activité d'une communauté microbienne occupant un habitat bien défini (environnement ou animal hôte). L'étude des microbiomes vise à comprendre la contribution et l'impact de l'activité de la communauté microbienne. Contrairement à la méthode traditionnelle d'étude des espèces individuelles, l'accent est mis ici sur la communauté entière et la contribution des espèces individuelles au sein de cette communauté. Les trois grandes questions auxquelles les technologies disponibles permettent actuellement de répondre sont les suivantes : (i) quelles espèces sont là ? (ii) que peuvent-elles faire ? (iii) que font-elles ?Deux technologies analytiques sont couramment : la spectrométrie de masse pour les protéines et le séquençage de nouvelle génération pour les acides nucléiques. Avant d'utiliser ces technologies, le traitement pré-analytique des échantillons est une étape cruciale. Il existe des protocoles distincts pour la métaprotéomique, la métagénomique ou la métatranscriptomique afin de traiter les échantillons microbiens. Mais il n'existe toujours pas de système intégré permettant de préparer les échantillons pour ces différentes analyses.L'étude actuelle a permis de développer un protocole utilisant un dispositif microfluidique appelé ChipFilter pour effectuer une préparation automatisée et intégrée des échantillons pour la métaprotéomique et l'isolement séquentiel des acides nucléiques. Le ChipFilter a été développé précédemment dans le laboratoire pour effectuer la préparation d'échantillons pour la protéomique. Dans le présent travail, j'ai d'abord amélioré cette technologie pour effectuer la lyse de cellules bactériennes et fongiques, la purification des protéines, la protéolyse et l'isolement des acides nucléiques. Cinq différents protocoles permettent une préparation efficace des échantillons pour la métaprotéomique seule ou la méta-protéomique. Les flux de travail 1 à 3 ont permis la préparation d'échantillons avec lyse cellulaire, purification des protéines, protéolyse et récupération des peptides pour LC-MS/MS. Le tampon de lyse modifié dans le protocole 5 a permis une lyse cellulaire accrue des bactéries Gram +ve. Le protocole 4 a permis de récupérer les acides nucléiques après la récupération des peptides.Tous les protocoles ont été validés avec des mélanges standards - (1) un mélange de nombre égal de cellules de E. coli, S. cerevisiae et B. subtilis ; (2) vingt et une espèces de nombre disproportionné de cellules représentants le microbiome intestinal. Enfin, la validation du protocole métaprotéomique utilisant ChipFilter a été effectuée en utilisant le microbiome intestinal de la souris isolée à partir des fèces. La comparaison du protocole de ChipFilter avec les protocoles standards a montré une meilleure couverture du proteome avec le ChipFilter. Les peptides générés contenaient plus de sites de clivages manqués, ce qui a conduit à des séquences peptidiques plus longues et à une meilleure couverture des protéines. Nous avons identifié des protéines pour au moins 20 espèces parmi les 21 considérées. Le traitement du lysat du microbiome intestinal de la souris a conduit à l'identification de 650 protéines en moyenne à partir de quatre réplicats biologiques. En ce qui concerne les acides nucléiques extraits, leur stabilité structurelle, le mécanisme de leur rétention dans le ChipFilter et la validation par PCR ont été effectués.En conclusion, un protocole complet de préparation d'échantillons utilisant le ChipFilter a été réalisé pour la méta-protéogénomique. Ce protocole de préparation d’échantillon est automatisable, il peut être facilement intégré avec les étapes de collecte d'échantillons, et il permet d'effectuer des études multi omiques simultanément sur le même échantillon en permettant d'identifier un nombre élevé de peptides, ce qui le rend très prometteur pour des études de microbiome à haut débit.